Экологические аспекты современной биотехнологии

В первой фазе брожения принимают участие микроорганизмы, обладающие целлюлолитической, протеолитической, липолитической, сульфатвосстанавливающей, денитрифицирующей и други­ми видами активности. Состав доминирующей микрофлоры данной фазы зависит от состава микрофлоры поступающего в ме-тантенки субстрата, а также от химической природы деградиру-емых органических веществ. Количество аэробных и факульта­тивно анаэробных микроорганизмов в первой фазе брожения достигает 106 кл/мл, содержание облигатных анаэробов на 2—3 порядка выше. Целлюлозоразрушающие анаэробные бактерии в метантенках могут накапливаться в количестве до 106 кл/мл. Среди бактерий, разрушающих гемицеллюлозу, обнаружены штаммы Bacterioides ruminicola, Butyrivibrio fibriosolvens и др.

Протеолитические бактерии, используемые в промышленности относятся к роду Clostridium (28 штаммов из 43 выделенных), Peptococcus anaerobis (8 штаммов), к родам Bacterioides и Eubacterium (3 штамма), а также к родам, близким к Bifidobacterium. Общее количество микро­организмов, обладающих протеолитической активностью, в ме­тантенках достигает 105 кл/мл. Отмечается, что до 50 % выде­ленных бактерий, участвующих в метановом брожении, образуют споры. Влияние микробиологического состава поступившего в ме-тантенк субстрата на микрофлору метанового брожения хорошо видно на примере анаэробного сбраживания стоков свиноферм, в культуральной жидкости которых обнаружено до 50 % энтеробактерий Е. coli и анаэробных стрептококков. В этом опыте пер­выми развивались бактерии, обладающие амилолитической активностью, а позднее — обладающие целлюлолитической и протеолитической активностями.

Существенная роль в процессах метанового брожения принадлежит ацетогенными и водородпродуцирующим бактериям. Эти бактерии, например Syntrophobacter wolinii, превращают пропионат в ацетат, СО2, если в среде одновременно при­сутствуют водородпотребляющие бактерии. Водород образуется при окислении NADH2 с образованием NAD. Содержание водоро­да в среде зависит не только от ацетогенных бактерий, но и от водородпотребляющих метаногенов. Метаногенная система будет работать эффективно тогда, когда парциальное давление водоро­да будет низким. При этом условии углеродные соединения кон­вертируются в ацетат, СО2 и будут плохо накапливаться различные жирные кислоты. В условиях загрузки биореактора легкодеградируемым субстратом концентрация СО2 может увели­чиваться и в среде будут накапливаться пропионовая, масляная и другие органические кислоты.

В третьей фазе — метаногенной — участвуют метанобразующие бактерии. Эта группа анаэробных бактерий принадлежит к древнейшему царству живых существ — архибактериям. Строе­ние и метаболизм метанобразующих бактерий сильно отличаются от прокариот. Так, у метаногенов маленький геном — около '/з генома кишечной палочки. Исследования последних лет показа­ли, что последовательность нуклеотидов в РНК у метаногенов и у обычных бактерий существенно различаются. Энергию для роста эти бактерии получают при восстановлении наиболее окисленного соединения СО2 до наиболее восстановленного СН4. Предполагаемый путь автотрофной ассимиляции СО2 у Methano­bacterium thermoautotrophicum показан на рис. 3.

Таблица 8. Фазы метанового брожения

Биогидролиз   полимеров   и   ацидогенез

Гидролитические ацетогенные

Комплекс   оргашче-    Высшие жирные кис-
ских веществ                   лоты

Ацетогенез   и   дегидрогенизация Водородпродуцирующие бактерии     Высшие жирные кис-    На, СО2, СН3СООН

Метанобразующие бактерии

Метаногенез

На, СО2, СНзСООН

СН4, СО2

Галактозо-КНг

|Аспартат{

Оксал о ацетат

I

Малат Фумарат

Сукцинат

ATP I

Сукцинил-СоА

(С02) 1   факт°Р 420ВОСС а-кетоглутарат

Гексозофосфат

Триоэофосфат

АТР

Фосфоенолпирув ат

Пентоэофосфат

Рис.  3.

Предполагаемая схема автотрофной ассимиляции СО2 у бакте­рий Methanobacterium thermoautotrophicum

После создания Хангейтом Р. Э. в 1985 г. упрощенной техники культивирования метанобразующих бактерий удалось выде­лить 30 видов метаногенов, принадлежащих к 14 родам и 6 семействам. Некоторые представители метанобразующих бактерий приведены в табл. 11.9. По форме клеток метаногены являются кокками или палочками различных размеров и подвижности. Некоторые представители Methanobacterium и особенно Methanothrix могут образовывать даже нитеобразные клетки. Строение клеточной стенки у метаногенов отличается от таковой у обычных бактерий.

В качестве субстрата многие метаногены потребляют формиат, который трансформируют в метан:

4HCOOH-CH4+3CO2+2H2O

Таблица 9. Характеристика метанобразующих бактерий

Methanobacterium

formicum

bryantii

thermoautotrophicum Methanobrevibacterium

ruminantium

smithi

orboriphilus Methanococcus

vannielii

voltae

thermoiithotrophicus

mazei

Methanomicrobium mobile

Methanobacterium cariaci marisnigri

Methanospirillum hunga-tei

Methanosarcina barken

Methanolhrix soehngenii

Methanothermus fervidus

Палочки от длинных до ни­теобразных; в клеточной стенке содержится псевдо­муреин

Комки, короткие палочки; в клеточной стенке содер­жится псевдомуреин

Подвижные нерегулярные небольшие кокки; в клеточ­ной стенке содержатся по­липептидные субъединицы

Подвижные короткие палоч­ки и нерегулярные под­вижные небольшие кокки; в клеточной стенке содер­жатся полипептидные субъ­единицы

Подвижные небольшие не­регулярные кокки; в клеточ­ной стенке содержатся по­липептидные субъединицы Подвижные палочки; в кле­точной стенке содержатся полипептиды

Нерегулярные кокки, сгруп­пированные в пакеты; в кле­точной   стенке   содержатся гетерополисахариды Палочки от длинных до ни­тей; в клеточной стенке не содержится     муравьиная кислота

Неподвижные палочки; в клеточной стенке содержит­ся псевдомуреин

Водород и формиат

Водород

То же

Водород и формиат

То же

Водород

Водород и формиат То же

»

Водород, метанол, метил­амин, ацетат Водород и формиат

То же

Водород и формиат

Водород,    ацетат,    мета­нол, метиламин

Ацетат

Водород

При переработке различных коммунальных и промышленных стоков пищевых производств основным субстратом для метаногенов является ацетат, который также превращается в метан:

СН3СООН -СН4 + СО2.

К этой группе метаногенов относятся Methanosarcina barkeri Methanococcus mazei, Methanothrix soengenii. При конверсии ацетата в метан с их помощью очень мало изменяется свобод­ная энергия субстрата (AG6 = —32 кДж), поэтому скорость их роста низка и их генерация длится не менее 10 сут.

Некоторые метаногены, как следует из таблицы 9, конвертируют в метан также метанол и метиламин:

4/3 СН3СООН -СН4 + ½ СО2  + 2/3 H2O.

4/3 СН3NH2 + 2/3 H2O - СH4  + 1/3 CO2.

Метан при метановом брожении получается также из СО2 и Н2, образующегося в результате деятельности в основном ацетогенных бактерий. Предполагаемая схема восстановления СО2 до метана представлена на рис. 11.4. Согласно этой схеме перенос­чиками С] являются метаноптерин (МР) и 7,8-дигидрометанопте-рин (ДНМР) , коферменты FA и М.

Количество газа, получаемого из 1 моля кислоты в процессе брожения, можно определить по уравнению Басвелла:

сnнa0b + ( „ - i

COOH-DHMP

t

НСО-МР

HS-CoM         СНгОН-8-СоМ

CH,-&-CoM

„   CoM*

Рис.    11.4.   Предполагаемая   схема   восстановления СО2 в метан метаногенами

где п, a, b — число атомов углерода, водорода и кислорода в соответствующей кислоте при 30 °С и нормальном давлении.

С увеличением длины углеродной цепи кислоты увеличивается количество получаемого газа. Так, из 1 г муравьиной кислоты получается газа 540 мл, из 1 г уксусной — 823 мл, из 1 г масля­ной — 1055 мл, из 1 г капроновой — 1224 мл.

Исследования, проведенные экологами, показали, что при термофильном метановом сбраживании паточной барды спиртового производства с содержанием СВ 4,2 % при суточной замене 10 % среды из 1 объема ферментационной жидкости выделяется 22 объема газа. Общее содержание кислот в жидкой среде 2,5 %, в том числе муравьиной — 0,46 %, уксусной — 0,79 %, пропио-новой — 0,86 %, масляной — 0,39 %. Экспериментально установ­лено, что по скорости сбраживания органические кислоты рас­пределяются в следующем нарастающем порядке: пропионовая, капроновая, валериановая, муравьиная, масляная, уксусная. Наиболее интенсивно сбраживается уксусная кислота.

Метаногенез зависит в большой степени от химического со­става среды и физических факторов. Прежде всего необходимо иметь в виду, что метаногены строгие анаэробы и кислород является для них ядом. Значение окислительно-восстановительного потенциала (еН), при котором лимитируется рост метаноге-нов, равно 330 мВ; оптимум — примерно — 400 мВ. Присутствие одной молекулы О2 в 10 л воды ингибирует метаногенез. Однако наши исследования показали, что кратковременная аэрация метантенка не приводит к гибели метаногенов, так как сопутствую­щая факультативно анаэробная микрофлора утилизирует кисло­род и через 2 сут метаногенез возобновляется (рис. 5).

Мета-нобразующие бактерии хорошо развиваются и метаболизируют субстрат в метан при рН 6—8. Однако различные представители по-разному реагируют на из-

менение рН среды. В метан-тенках рН поддерживают на уровне, близком к нейтраль­ному или щелочному.

По температурному оп­тимуму различные метаноге­ны сильно различаются. В природе встречаются как психрофилы, так и термо­филы, выживающие даже при 97 °С. Большинство ме-тантенков работает в мезо-фильном режиме при 35— 45 °С. Термофильная фер­ментация (при 50—57 °С) идёт менее интенсивнее, чем мезофильная, однако процесс отличается меньшей стабильностью.

Биомасса метанобразующих бактерий состоит из 54 % углерода, 20 % кислорода, 10 % водорода, 12 % азота, 2 % фосфора и 1 % серы. Кроме того, в биомассе содержатся калий, натрий, кальций, магний и ряд микроэлементов, наиболее важные из ко­торых кобальт, молибден и никель. Чтобы обеспечить формиро­вание клеточной массы, в среде должны содержаться необходи­мые питательные вещества. Соотношение ХПК: N:P должно быть 700:5:1, нельзя допускать избытка азота (C:N не менее 20:1). Уровень токсичности ионов аммиака для метанобразующих бак­терий 1500—2000 мг/л; цианида (CN~) —0,5—1,0 мг/л; калия, натрия и кальция — 3000—6000 мг/л.

Ингибирование метаногенеза вызывают сульфиты, которые при метановом брожении сульфатвосстанавливающие бактерии восстанавливают до H2S. Метаногенез ингибируется при концентрации сульфидов 100—159 мг/л. При метаногенезе на 50 % сокращается содержание растворимых солей тяжелых металлов при следующих концентрациях ионов (в мг/л}: железо— 1 —10; цинк— 10~4; кадмий— 10~7; медь —10~12 и 10~1 (для двухвалентной формы).

Процесс метаногенеза замедляется в присутствии различных детергентов (при их концентрации около 15 мг/л), антибиотиков и других веществ. Если метановое брожение не ингибировано, при 35 °С выход метана составляет 0,34—0,36 м3 из 1 кг расходованного ХПК или 0,91—0,93 м3 из 1 кг использованного органи­ческого углерода. Можно считать, что в среднем из 1кг ХПК получают 0,35 м3 метана. Если эти показатели ниже, то можно предполагать, что метаногенез ингибируется каким-либо факто­ром. Об этом свидетельствуют, например, изменение реакции среды (подкисление), накопление пропионата. Сумма летучих жирных кислот в среде не должна быть выше 250 мг/л.

Для восстановления интенсивности метанового брожения можно снижать скорость подачи субстрата, подщелачивать среду химическими веществами, разбавлять стоки водой, удалять токсические соединения путем предварительной обработки стоков. Интенсифицировать метановое брожение можно также, разделяя процесс на две стадии: первую — предварительную, в которой в отдельном аппарате или секции реализуется гидролиз субстратов, и вторую — собственно метаногенез. Это позволяет локали­зовать специфическую для каждой стадии микрофлору и обеспечить наиболее благоприятные условия для развития каждой группы микроорганизмов: в первой — преимущественно гидролитическую и ацетогенную, во второй — главным образом метаногены. Установлено, что метаногены любят адгезировать на по­верхностях, поэтому во второй секции можно помещать специальные иммобилизующие средства (щетки, гранулы и т.д.).

Так как метанобразующие бактерии имеют низкую скорость роста, важно технологическими методами обеспечить их высокую концентрацию в биореакторе. Один из таких методов — иммобилизация клеток на поверхности носителей. Нами установлено, что на щетках из капроновых волокон уже через 2—3 нед ферментации накапливается в 2—3 раза больше метаногенов, чем в жидкости.

Оригинальный метод повышения концентрации биомассы разработан в 1970 г. Леттингом Г., Зендером А. и др. В биореакторе создают условия, способствующие естественному образованию гранул бактериальной биомассы под воздействием факторов среды и гидродинамического режима. Например, направляя поток среды снизу вверх, достигают выноса из реактора нефлокулирующих микроорганизмов. Этим создаются благоприятные усло­вия для накопления биомассы флокулообразующих сарцин и нитеобразующих форм бактерий (например, из рода Methanot-hrix). Гранулообразованию способствует выбор специального субстрата. Так, Methanosarcina и Methanothrix утилизируют пре­имущественно ацетат, следовательно, в среде должен быть аце­тат.

Для накопления в среде ацетата в начале процесса устанавливают небольшие скорости загрузки биореактора, чтобы создать условия для утилизации и трансформации всех высших жирных кислот. Кроме того, в среде должны быть ионы кальция, которые способствуют флокуляции. При таких условиях в нижней части биореактора постепенно накапливаются гранулы величиной 0,5— 2,5 мм с хорошими седиментационными свойствами. В реакторе не должно быть механического перемешивания, чтобы не дефор­мировать и не разрушить гранулы. В верхней части биореактора необходимо устанавливать сепарационное устройство, в котором гранулы отделяются от жидкой фазы и возвращаются в нижнюю часть аппарата. Кроме того, в сепарационном устройстве отделя­ется также газовая фаза. По такому же принципу созданы и эффективно работают биореакторы с верхним вводом потока и с толстым слоем шлама (биореактор UASB — Upflow Anaerobic Sludge Blanket Reactor).

Схема такого биореактора приведена в табл. 10. В нижней части биореактора в слое высотой 1,5—2,5 м концентрация биомассы достигает 50—100 кг/м3; над этим слоем концентрация биомассы 5—20 кг/м3. В оптимальных условиях биореактор обе­спечивает суточную загрузку ХПК до 15 кг/м3, полная замена субстрата происходит за 4 ч при степени очистки 70—90 %.

Таблица 10. Системы анаэробной очистки сточных вод

Анаэробные лагуны   Система отстойников, в         Стони

которых стоки пребыва-          I Биогаз       Виозоз

ют от нескольких недель              .T_i_i_i_    __ t M   1Т,{]'илц?н-

7777Z

до 2 мес. газы свободно    г..                                   ъныеамю

выделяются в атмосферу

Продолжение

Для анаэробного брожения стоков применяют различные биореакторы очень больших объемов, изготовленные из металла или железобетона, в виде вертикальных и горизонтальных цилиндров или прямоугольных резервуаров. В Китае, Индии и некоторых других странах Азии успешно используют небольшие биореакторы объемом до 10 м3 очень простой конструкции для утилизации отходов домашнего хозяйства. Количество таких биореакторов составляет более 10 млн. В развитых странах по­строено множество крупных биогазовых установок для очистки стоков промышленных предприятий и отходов ферм. Метановое брожение традиционно применяют при очистке городских стоков, для утилизации активного ила после аэробной ферментации.

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5