Биофизика. (шпаргалка к экзамену)

30.    Денатурация белка. Её термодинамическая характеристика. Этапы денатурации белка. Механизмы денатурации. Способы денатурации.

Денатурация – это процесс разрушения нативной пространственной структуры белка. Этот процесс сопровождается изменением функциональной активности, упорядоченности боковых групп и фиксированности глобулярной структуры. В термодинамическом плане денатурация сопровождается увеличением энтропии и уменьшением свободной энергии белка. Существует два механизма денатурации для малых и крупных белковых молекул.

1.   

2.   

В первом случае процесс денатурации представляет собой ФП 1 рода, что обеспечивается наличием большого числа слабых связей с глобуле.

Во втором случае на первом этапе плавления глобулы происходит нарушение упорядоченности боковых групп, но сохраняется общая пространственная структура. Этот переход происходит как ФП 1 рода. Дальнейшие этапы денатурации зависят от доменной и вторичной структуры и могут происходить как ФП любого рода.

Расплавленная глобула является устойчивым интермедиатом разворачивания белка и характеризуется минимумом свободной энергии.

По способам денатурации различается

1.    Температурная.

Существует тепловая и холодовая денатурация. При тепловой происходит разрушение связей за счёт увеличения скорости теплового движения, а при Холодовой происходит ослабление гидрофобных взаимодействий, что приводит к падению стабильности белка.

2.    Химическая.

Связана с оттягиванием части водородных связей химическими веществами, часто электролитами, что приводит к падению устойчивости боковых групп. (мочевина, гуанидин гидрохлорид)

3.    Лучевая.

Лучевая денатурация связана с поглощением атомами энергии, приводящим к разрыву ковалентных связей.

31.    Самоорганизация белка. Этапы самоорганизации белка. Термодинамическая оценка процесса самоорганизации. Особенности процесса самоорганизации белка в условиях in vivo. Парадокс Левинталя, его сущность и разрешение.

Самоорганизация – это путь к глобальному минимуму свободной энергии. Этот путь единственно возможный в данных условиях для данной молекулы. Для белков процесс самоорганизации заключается в образовании пространственной структуры.

В процессе ренатурации белка разные стадии представляют собой фазовые переходы разного рода. Для малых белков процесс можно считать одностадийным. Этот процесс происходит как ФП 1 рода.

Для крупных белков этот процесс многостадийный, и разные его стадии происходят как ФП разного рода.

Ранние этапы самосборки различаются в зависимости от типа вторичной структуры.

Образование α-спирали происходит как нефазовый переход, так как оба фазовых состояния одномерны и не происходит изменения границы фаз.

Образование β-листов происходит как ФП 1 рода, площадь контакта цепи с листом зависит от размера контактирующих элементов. Процесс образования β-структуры происходит значительно дольше.

Процесс образования нативной структуры из расплавленной глобулы происходит как ФП 1 рода. В процессе этого перехода происходит уменьшение энтропии системы, компенсированное падением свободной энергии. Это обеспечивается наличием большого числа слабых связей с низкой энергией.

К ФП 2 рода могут относиться процессы образования и разрушения доменных структур, которые часто сопровождаются ростом теплоёмкости системы.

Парадокс Левинталя заключается в том, что каждый АК остаток имеет порядка 10 возможных конформаций, цепь из 100 АК остатков будет иметь 10100 возможных конформаций. При этом, белок должен менять свою конформацию в сторону наименьшей свободной энергии и "почувствовать" стабильное состояние. При этом перебор возможных состояний даже короткой цепи в 100 АК потребовал бы 1080 лет при скорости перехода между конформациями порядка 10-13 секунд. Но при этом процесс образования нативной структуры происходит за время порядка 1 секунды.

Парадокс разрешается при учёте нуклеационного механизма сворачивания. Пространственная организация начинается в самом начале синтеза полипептидной цепи с образования ядра сворачивания. Ядро сворачивания образуется изначально из АК имеющих небольшое число разрешённых конформаций. В процессе синтеза цепи новые АК контактируют с ядром сворачивания, которое ограничивает число разрешённых конформаций. В процессе синтеза всё новые АК вовлекаются в ядро сворачивания, увеличивая его поверхность, скорость падения энергии системы возрастает. В этом заключается котрансляционный механизм сворачивания. Образование зародыша сворачивания соответствует локальному энергетическому минимуму, а далее система стремится к глобальному энергетическому минимуму – к нативной структуре.

Также в клетке могут присутствовать ферменты, катализирующие отдельные этапы самосборки – фолдазы, а также шаперолы, белки теплового шока, способные стабилизировать структуру синтезируемого белка, формируя с ним нековалентные связи.

32.    Механизмы ферментативного катализа на примере работы сериновых протеаз.

В общем виде механизм ферментативного катализа представлен несколькими стадиями:

Сериновые протеазы катализируют процесс расщепления пептидной связи. Без участия фермента реакция идёт через промежуточное состояние тетраэдрического комплекса. Это состояние характеризуется высоким уровнем свободной энергии и для протекания реакции в отсутствии фермента необходимо преодоление высокого энергетического барьера.

Сериновые протеазы стабилизируют переходное состояние и таким образом снижают энергетический барьер.

Активный центр состоит из каталитического центра, непосредственно осуществляющего химическую трансформацию и из субстрат-связывающего центра, обеспечивающего правильное расположение субстрата в пространстве относительно каталитического центра.

Главным каталитическим центром является боковая цепь серина(195), от которой отщепляется протон, расположенным рядом остатком гистидина, при участии аспартата. Углеродный атом пептидной связи образует временную ковалентную связь с активным центром, переходя в тетраэдрическую форму. Но образующийся тетраэдрический комплекс имеет меньшую свободную энергию, так как "–" заряд карбоксильной группы втягивается в оксианионовую дыру(протоны, образующие водородные связи), а донором протона является гистидин, удобно расположенный в пространстве, благодаря неспецифической пептид-связывающей площадке, ориентирующей пептидную связь относительно активного центра. Всё это снижает неопределённость системы, уменьшает энтропию и свободную энергию системы.

В общем случае эффект действия ферментов обеспечивается эффектами:

1.    сближения фермента и субстрата, что эквивалентно увеличению их концентрации.

2.    ориентации участников реакции в пространстве друг относительно друга.

3.    стабилизации промежуточного продукта реакции.

4.    поляризации и перераспределения электронной плотности субстрата.

5.    индуцированного соответствия фермента и субстрата.

33.    Конформационные изменения в белке. Их значение для работы белка.

Конформационные изменения играют большую роль в функционировании белка. Это определяется, во-первых, индуцированным соответствием пространственной структуры: Изначально фермент находится в открытом состоянии, способном присоединять субстрат, соединение с субстратом вызывает конформационные изменения фермента и субстрата. Фермент переходит в закрытую форму. В закрытой форме фермент осуществляет катализ и под действием продуктов снова меняет конформацию на открытую и отщепляет продукты реакции.

Во-вторых, конформационные изменения могут играть роль для выполнения собственно рабочего действия белка или для перехода от одного режима действия к другому.

Примеры: K/Na-АТФаза, Воротный механизм ионных каналов, аллостерическая регуляция ферментов.

34.    Внутримолекулярная динамика белка. Изменения конформации гемоглобина при оксигенации. Роль аллостерических регуляторов.

Каждая субъединица гемоглобина несёт одну группу гемма, расположенную между F и E спиралями глобина. Атом Fe образует 4 связи с атомами азота пиррольных колец, одну связь с гистидином и одну связь с O2 или CO2.

Функционально гемоглобин может находиться в двух конформационных состояниях:

Высокоспиновое:

d-электроны расположены таким образом, чтобы число неспаренных электронов было максимальным. Диаметр атома больше и выступает над плоскостью гема. Атом железа имеет 5 связей и способен присоединять кислород.

Низкоспиновое:

d-электроны расположены таким образом, что число неспаренных электронов минимально. Атом железа имеет меньший радиус и находится в плоскости гема. Железо имеет 6 связей.

Переход в низкоспиновое состояние происходит при присоединении кислорода, это приводит к уменьшению радиуса атома железа и втягиванию его в плоскость гема. Это перемещение вызывает изменение всей конформации полипептидной цепи глобина. Конформационные изменения одной субъединицы вызывают изменения других субъединиц. Это приводит к тому, что атом железа втягивается в плоскость гема до присоединения кислорода, что вызывает повышение сродства гема к кислороду. Таким образом, присоединение последних атомов кислорода к гемоглобину происходит легче. Таким образом происходит кооперативное взаимодействие субъединиц гемоглобина.

Аллостерическая регуляция происходит аналогичным образом. Присоединение регулятора к ферменту вызывает комплекс конформационных перестроек, что приводит к изменению функциональной активности фермента, его активации.

35.    Прогнозирование и дизайн белковых структур.

Для расчёта пространственной структуры на основе АК последовательности используют два общих подхода:

·        Гомологичное моделирование

Создаётся база шаблонов первичной структуры и их структурообразующих свойств. Сходства последовательностей достаточно для сходства пространственной структуры.

·        Математическое моделирование

Производится расчёт структуры с минимальной свободной энергией или моделируется наиболее оптимальный процесс сворачивания структуры. Этот метод более точен, но требует намного больших вычислительных мощностей. Для него используются сети распределённого вычисления и суперкомпьютеры.

"Метод протягивания" заключается из предположения о том, что большинство вариантов третичной структуры уже известны. Производится перебор конформаций, расчёт их стабильности и выбор конформации с минимальной свободной энергией.

Направление белкового дизайна занимается моделированием белков с заданными свойствами. Главной проблемой этого направления является нестрогое соответствие между структурой и функциями белка. Существуют белки со схожей пространственной структурой, но выполняющие разную функцию, и наоборот.

Методы белкового дизайна подразделяются на: теоретические (основаны на знании соответствия между структурой и функциями АК последовательностей в реальных белках) и практические (основанные на методах точечных мутаций и синтеза искусственных белков).

37.    Законы поглощения электромагнитного излучения веществом. Спектрофотометрия, её физические основы.

Спектрофотометрия – это область физики исследующая распределение электромагнитного излучения по длинам волн или частотам.

В наиболее общем случае все спектрофотометрические методы основаны на анализе интенсивностей света разной длины волны поглощенного веществом или прошедшего через него. Атомы и молекулы имеют дискретные энергетические уровни. Если на вещество падает ЭМ волна, то энергия, равная разнице энергии перехода между энергетическими уровнями может поглощаться. При этом происходит снижение интенсивности излучения. Этот переход осуществляется с разной вероятностью при разных длинах волн.

Интенсивность поглощения, по закону Бугера-Ламберта-Бэра:.

В этом соотношении интенсивность света, прошедшего через слой вещества экспоненциально зависит от толщины слоя и концентрации вещества.

Оптическая плотность вычисляется как десятичный логарифм отношения интенсивностей света до образца и после образца:

Измеряя оптическую плотность раствора при определённых длинах волн можно определить концентрацию поглотителя в растворе. Также возможно построение спектра поглощения в определённом диапазоне длин волн, затем этот спектр можно использовать при качественном анализе состояния системы, конформационные переходы и химические превращения часто отражаются на форме спектра поглощения.

Спектрофотометрические методы часто делятся по диапазону используемых длин волн. Область спектрофотометрии в видимом диапазоне длин волн называют колориметрией.

Спектральное положение линии определяется разницей энергии состояний, между которыми осуществляется переход.  Здесь они расположены в порядке уменьшения энергии. Энергиям электронных переходов соответствуют области спектра высоких энергий и высокой частоты, спектр поглощения энергии на увеличение колебательного и вращательного движения расположен в области с низкими частотами и низкой энергией.

Ширина спектральных линий определяется естественным уширением по причине грубости фиксирующих приборов. Также большую роль играют взаимодействия с другими частицами, доплеровское смещение частот за счёт теплового движения и изменение спектров за счёт межмолекулярных взаимодействий.

38.    Спектроскопические методы в биофизике. Их физические основы, задачи спектроскопии, классификация спектроскопических методов.

Спектроскопия – это область физики исследующая распределение электромагнитного излучения по длинам волн или частотам.

В наиболее общем случае все спектроскопические методы основаны на анализе интенсивности реакции вещества на воздействие определённой интенсивности и частоты. Этим воздействием могут являться ЭМ волны, магнитное поле, γ-лучи.

Атомы и молекулы имеют дискретные энергетические уровни. Если на вещество падает ЭМ волна, то энергия, равная разнице энергии перехода между энергетическими уровнями может поглощаться. При этом происходит снижение интенсивности излучения. Этот переход осуществляется с разной вероятностью при разных длинах волн.

Интенсивность поглощения, по закону Бугера-Ламберта-Бэра:.

В этом соотношении интенсивность света, прошедшего через слой вещества экспоненциально зависит от толщины слоя и концентрации вещества.

Эта зависимость используется в спектрофотометрических методах.

В качестве воздействия может использоваться переменное магнитное поле высокой частоты, которое поглощается ядрами или электронами в постоянном магнитном поле. На этом основаны методы ЯМР и ЭПР.

γ-лучи используются в методе мессбауэровской спектроскопии, так как они могут поглощаться тяжёлыми атомами металлов.

Свойства спектральной линии.

Интенсивность определяется количеством поглотителя в исследуемом объекте.

Спектральное положение линии определяется разницей энергии состояний, между которыми осуществляется переход.

Ширина спектральных линий определяется естественным уширением по причине грубости фиксирующих приборов. Также большую роль играют взаимодействия с другими частицами, доплеровское смещение частот за счёт теплового движения и изменение спектров за счёт межмолекулярных взаимодействий.

Методами спектроскопии возможно изучение химического состава объектов, количественный анализ, а также структурный анализ, так как изменение структуры вещества часто отражается на характере его спектра.

39.    Метод электронного парамагнитного резонанса. Физические принципы и применение в изучении биополимеров.

Если внести частицу в определённым магнитным моментом в постоянное магнитное поле, то магнитный момент выстроится вдоль направления магнитного поля и будет прецессировать с частотой . Если теперь на частицу действовать слабым переменным магнитным полем, направленным перпендикулярно опорному полю, то при совпадении частоты переменного измерительного поля с частотой прецессии частицы, возникнет резонанс и сильное поглощение волны измерительного поля.

Электрон имеет спин ½, его энергетический уровень расщепляется на два, что соответствует переходу между спинами. В большинстве органических соединений спины электронов скомпенсированы и ЭПР не наблюдается. ЭПР наблюдается только у свободных радикалов и молекул с нечётным числом электронов, при этом, проявляются характеристические спектры, зависящие от электронного строения системы.

ЭПР используется при изучении реакций с участием свободных радикалов или белков, содержащих в качестве кофакторов атомы металлов с нескомпенсированным спином.

Также широко используется приём присоединения к исследуемым молекулам спиновых метоков и эффект Мессбауэра как анализатор.структуры атома, окружающих групп и характера цессии частицы, и частицы с чь слабым переменным магнитным полем, направленным перпендикулярно опорному полю, то при совпаде – свободных радикалов, содержащих неспаренный электрон. ЭПР спектр спин-метки зависит от её электронного окружения, конформации молекулы, к которой она присоединена.

40.    Метод ядерного магнитного резонанса. Физические принципы и применение в изучении биополимеров.

Если внести частицу в определённым магнитным моментом в постоянное магнитное поле, то магнитный момент выстроится вдоль направления магнитного поля и будет прецессировать с частотой . Если теперь на частицу действовать слабым переменным магнитным полем, направленным перпендикулярно опорному полю, то при совпадении частоты переменного измерительного поля с частотой прецессии частицы, возникнет резонанс и сильное поглощение волны измерительного поля.

Ядерный спин имеют атомы, у которых нечётно хотя бы одно атомное число, массовое или порядковое. Ядерный спин равен нулю у  и не равен нулю у

При включении магнитного поля для протона возникают два уровня, соответствующие параллельному и антипараллельному направлениям спина. Частоту переменного поля увеличивают до тех пор, пока она не достигнет некого предела, выше которого резонанс невозможен, а интенсивность поглощения записывают. В результате получается спектр поглощения, который подвергается анализу. Сигналы ядер атомов, входящих в определенные функциональные группы, лежат в строго определенных участках спектра, а интегральная площадь, ограниченная пиком, строго пропорциональна количеству резонирующих атомов. Таким образом, можно получить количественные и качественные характеристики образца.

Одни и те же ядра атомов в различных окружениях в молекуле показывают различные сигналы ЯМР. Отличие такого сигнала ЯМР от сигнала стандартного вещества позволяет определить так называемый химический сдвиг, который обусловлен химическим строением изучаемого вещества. В методиках ЯМР есть много возможностей определять химическое строение веществ, конформации молекул, эффекты взаимного влияния, внутримолекулярные превращения. Это позволяет определить структуру окружения атомов и структуру самого вещества.

Используют также приёмы обогащения образцов контрастирующими метками, наблюдения процессов включения метки в состав объекта. Важным свойством метода является возможность его использования на живых биологических объектах.

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6