Биологическое окисление
p> В отличие от этого молекулы, передающие электроны цитохромоксидазному
комплексу, по-видимому, не переносят протонов, и в этом случае транспорт
электронов, вероятно, связан с определенным аллостерическим изменением
конформации белковых молекул, в результате которого какая-то часть
белкового комплекса сама переносит протоны.
Действие разобщителей. С 40-х годов известен ряд липофильных слабых кислот, способных
действовать как разобщающие агенты, т.е. нарушать сопряжение транспорта
электронов с синтезом АТФ. При добавлении к клеткам этих низкомолекулярных
органических соединений митохондрии прекращают синтез АТФ, продолжая при
этом поглощать кислород. В присутствии разобщающего агента, скорость
транспорта электронов остается высокой, но протонный градиент не создается.
Это простое объяснение этого эффекта: разобщающие агенты (например,
динитрофенол, тироксин) действуют как переносчики Н+ (Н+-ионофоры) и
открывают дополнительный путь - уже не через АТФ-синтетазу – для потока Н+
через внутреннюю митохондриальную мембрану.(13, 2000( Дыхательный контроль. Когда к клеткам добавляют разобщающий агент, например динитрофенол,
поглощение кислорода митохондриями значительно возрастает, так как скорость
переноса электронов увеличивается. Такое ускорение связано с
существованием дыхательного контроля. Полагают, что этот контроль основан
на прямом инги6ирующем влиянии электрохимического протонного градиента на транспорт электронов. Когда в присутствии разобщителя
электрохимический градиент исчезает, не контролируемый более транспорт
электронов достигает максимальной скорости. Возрастание градиента
притормаживает дыхательную цепь, и транспорт электронов замедляется. Более
того, если в эксперименте искусственно создать на внутренней
мембране необычно высокий электрохимический градиент, то нормальный
транспорт электронов прекратится совсем, а на некоторых участках
дыхательной цепи можно будет обнаружить обратный поток электронов. Это
позволяет предполагать, что дыхательный контроль отражает простой баланс
между изменением свободной энергии при перемещении протонов, сопряженного с
транспортом электронов, и изменением свободной энергии при самом транспорте
электронов.Величина электрохимического градиента влияет как на скорость,
так и на направление переноса электронов, так же как и на направление
действия АТФ-синтетазы. Дыхательный контроль - это лишь часть сложной системы взаимосвязанных
регуляторных механизмов с обратными связями, координирующей скорости
гликолиза, расщепления жирных кислот, реакций цикла лимонной кислоты и
транспорта электронов. Скорости всех этих процессов зависят от отношения
АТФ:AДФ - они возрастают, когда это отношением уменьшается в результате
усиленного использования АТФ. Например, АТФ-синтетаза внутренней
митохондриальной мембраны работает быстрее, когда концентрации ее
субстратов, т. е. .AДФ и Фн, увеличиваются. Чем выше скорость этой реакции,
тем больше протонов перетекает в матрикс, быстрее рассеивая тем самым
электрохимический градиент; а уменьшение градиента в свою очередь приводит
к ускорению транспорта электронов.[1,1994] Митохондрии бурой жировой ткани – генераторы тепла. Всем позвоночным в молодом возрасте для образования тепла, в дополнение к
механизму мышечного тремора, необходимо термогенное устройство. Такого рода
устройство особенно важно для животных, впадающих в зимнюю спячку. Мышцы в
состоянии тремора сокращаются и при отсутствии нагрузки, используя
сократительные белки для гидролиза АТФ обычным для мышечных клеток образом
и освобождая в виде тепла всю энергию, потенциально доступную при гидролизе
АТФ. Необходимость особого термогенного устройства определяется прочно
сопряженным окислительным фосфорилированием нормальных митохондрий. Если бы
этот процесс мог быть разобщен, как это бывает в присутствии динитрофенола,
он мог бы служить в качестве адекватного приспособления, производящего
тепло; именно так это происходит в митохондриях бурого жира. Хотя эти
митохондрий обладают обычной обратимой АТФазой, в них имеется также
трансмембранная протонная транслоказа, посредством которой протоны могут
возвращаться в матрикс и электрически шунтировать работу АТФазы. Если этот
процесс достаточен для того, чтобы поддерживать окислительно-
восстановительный потенциал водорода значительно ниже 200 мВ, синтез АТФ
становится невозможным и окислительный процесс протекает свободно, в
результате чего вся энергия освобождается в виде тепла.[2, 1994]
Цикл лимонной кислоты (цикл трикарбоновых кислот, цикл Кребса).
Цикл лимонной кислоты представляет собой серию реакций, протекающих в
митохондриях, в ходе которых осуществляется катаболизм ацетильных групп и
высвобождение водородных эквивалентов; при окислении последних
поставляется свободная энергия топливных ресурсов тканей. Ацетильные группы
находятся в составе ацетил-КоА (активного ацетата), тиоэфира кофермента А. Главная функция цикла лимонной кислоты состоит в том, что он является
общим конечным путем окисления углеводов, белков и жиров, поскольку в ходе
метаболизма глюкоза, жирные кислоты и аминокислоты превращаются либо в
ацетил-СоА, либо в промежуточные соединения цикла. Цикл лимонной кислоты
играет также главную роль в процессах глюконеогенеза, переаминирования,
дезаминирования и липогенеза, Хотя ряд этих процессов протекает во многих
тканях, печень - единственный орган, в котором идут все перечисленные
процессы. Поэтому серьезные последствия вызывает повреждение большого числа
клеток печени или замещение их соединительной тканью. О жизненно важной
роли цикла лимонной кислоты свидетельствует и тот факт, что у человека
почти не известны генетические изменения ферментов, катализирующих реакции
цикла, так как наличие таких нарушений несовместимо с нормальным
развитием.[10,1993] Открытие ЦТК. Впервые предположение о существовании такого цикла для окисления
пирувата в животных тканях было высказано в 1937 году Гансом Кребсом. Эта
идея родилась у него, когда он исследовал влияние анионов различных
органических кислот на скорость поглощения кислорода суспензиями
измельченных грудных мышц голубя, в которых происходило окисление пирувата. Грудные мышцы отличаются чрезвычайно высокой интенсивностью
дыхания, что делает их особенно удобным объектом для изучения окислительной
активности. Кребс также подтвердил, что обнаруженные ранее в животных
тканях другие органические кислоты (янтарная, яблочная, фумаровая и
щавелевоуксусная) стимулируют окисление пирувата. Кроме того, он нашел, что
окисление пирувата мышечной тканью стимулируется шестиуглеродными
трикарбоновыми кислотами - лимонной, цис-аконитовой и изолимонной, а также
пятиуглеродной (-кетоглутаровой кислотой. Испытаны были и некоторые другие
встречающиеся в природе органические кислоты, но ни одна из них не
обнаружила подобной активности. Обращал на себя внимание сам характер
стимулирующего действия активных кислот: даже малого количества любой из
них было достаточно для того, чтобы вызвать окисление во много раз большего
количества пирувата.[9, 1991] Простые эксперименты, а также логические рассуждения позволили Кребсу
высказать предположение, что цикл, который он назвал циклом лимонной
кислоты, является главным путем окисления углеводов в мышце. После, цикл
лимонной кислоты был обнаружен практически во всех тканях высших животных и
растений и у многих аэробных микроорганизмов. За это важное открытие Кребс
был удостоен в 1953 году Нобелевской премии. Юджин Кеннеди и Альберт
Ленинджер показали позднее, что все реакции цикла лимонной кислоты
протекают в митохондриях животных клеток. В изолированных митохондриях
печени крысы были обнаружены не только все ферменты и коферменты цикла
лимонной кислоты; здесь же, как выяснилось, локализованы все ферменты и
белки, которые требуются для последней стадии дыхания, т.е. для переноса
электронов и окислительного фосфорилирования. Поэтому митохондрии с полным
правом называют «силовыми станциями» клетки. Катаболическая роль цикла лимонной кислоты Цикл начинается со взаимодействия молекулы ацетил-СоА с
щавелевоуксусной кислотой (оксалоацетатом), в результате которого
образуется шестиуглеродная трикарбоновая кислота, называемая лимонной.
Далее следует серия реакций, в ходе которых происходит высвобождение двух
молекул С02 и регенерация оксалоацетата. Поскольку количество
оксалоацетата, необходимое для превращения большого числа ацетильных единиц
в С02, весьма невелико, можно считать, что оксалоацетат выполняет
каталитическую роль. Цикл лимонной кислоты является механизмом, обеспечивающим улавливание
большей части свободной энергии, освобождаемой в процессе окисления
углеводов, липидов и белков. В процессе окисления ацетил-СоА благодаря
активности ряда специфических дегидрогеназ происходит образование
восстановительных эквивалентов в форме водорода или электронов. Последние поступают в дыхательную цепь; при функционировании этой цепи
происходит окислительное фосфорилирование, то есть синтезируется АТФ. Ферменты цикла лимонной кислоты локализованы в митохондриальном
матриксе, где они находятся либо в свободном состоянии, либо на внутренней
поверхности внутренней митохондриальной мембраны; в последнем случае
облегчается перенос восстановительных эквивалентов на ферменты
дыхательной цепи, локализованные во внутренней митохондриальной
мембране.[11, 1989] Реакции ЦТК. Начальная реакция - конденсация ацетил-СоА и оксалоацетата,
катализируется конденсирующим ферментом, цитратсинтетазой, при этом
происходит образование связи углерод-углерод между метальным углеродом
ацетил-СоА и карбонильным углеродом оксалоацетата. За реакцией конденсации,
приводящей к образованию цитрил-СоА, следует гидролиз тиоэфирной связи,
сопровождающийся потерей большого количества свободной энергии в форме
теплоты; это определяет протекание реакции слева на право до ее завершения: Ацетил-СоА + Оксалоацетат + Н2О > Цитрат + CoA-SH Превращение цитрата в изоцитрат катализируется аконитазой, содержащей
железо в двухвалентном состоянии. Эта реакция осуществляется в две стадии:
сначала происходит дегидратация с образованием цис-аконитата (часть его
остается в комплексе с ферментом), а затем - гидратация и образование
изоцитрата: Цитрат ? цис -Аконитат ? Изоцитрат – Н2О Реакция ингибируется фторацетатом, который сначала превращается во
фторацетил-СоА; последний конденсируется с оксалоацетатом, образуя
фторцитрат. Непосредственным ингибитором аконитазы является
фторцитрат, при ингибировании накапливается цитрат. Эксперименты с использованием промежуточных соединений показывают,
что аконитаза взаимодействует с цитратом ассиметрично: она всегда действует
на ту часть молекулы цитрата, которая образовалась из оксалоацетата.
Возможно, что цис-аконитат не является обязательным интермедиатом между
цитратом и изоцитратом и образуется на боковой ветви основного пути. Далее изоцитратдегидрогеназа катализирует дегидрогенирование с
образованием оксалосукцината. Описаны три различных формы
изоцитратдегидрогеназы. Одна из них, НАД-зависимая, найдена только в
митохондриях. Две другие формы являются НАДФ-зависимыми, причем одна из них
также находится в митохондриях, а другая в цитозоле. Окисление изоцитрата,
связанное с работой дыхательной цепи, осуществляется почти исключительно
НАД-зависимым ферментом:
Изоцитрат + НАД+ ? Оксалосукцинат (в комплексе с ферментом) ?
альфакетоглутарат + СО2+ НАДН2 Рисунок 5. Реакции цикла Кребса.[10,1993] Далее следует декарбоксилирование с образованием
альфакетоглутарата, которое также катализируется
изоцитратдегидрогеназой. Важным компонентом реакции
декарбоксилирования являются ионы Mg2+ (или Мn2+). Судя по имеющимся
данным, оксалосукцинат, образующийся на промежуточной стадии реакции,
остается в комплексе с ферментом. Альфакетоглутарат, в свою очередь, подвергается окислительному
декарбоксилированию, сходному с окислительным декарбоксилированием
пирувата: в обоих случаях субстратом является альфакетокислота. Реакция
катализируется альфакетоглутаратдегидрогеназным комплексом и требует
участия того же набора кофакторов - тиаминдифосфата, липоата, НАД+, ФАД и
СоА; в результате образуется сукцинил-СоА - тиоэфир, содержащий
высокоэнергетическую связь. ?-кетоглуторат + НАД+ + CoA-SH > Сукцинил-СоА + СО2 + НАДН+Н+ Равновесие реакции настолько сильно сдвинуто в сторону образования
сукцинил-СоА, что ее можно считать физиологически однонаправленной. Как и
при окислении пирувата, реакция ингибируется арсенатом, что приводит к
накоплению субстрата (альфакетоглутарат). Продолжением цикла является превращение сукцинил-СоА в сукцинат,
катализируемое сукцинаттиокиназой (сукцинил-СоА-синтетазой): Сукцинил-СоА + ФН + ГДФ? Сукцинат + ГТФ + CoA-SH Одним из субстратов реакций является ГДФ (или ИДФ), из которого в
присутствии неорганического фосфата образуется ГТФ (ИТФ). Это -
единственная стадия цикла лимонной кислоты, в ходе которой генерируется
высокоэнергетическая фосфатная связь на субстратном уровне; при
окислительном декарбоксилировании ?-кетоглутарата потенциальное количество
свободной энергии достаточно для образования НАДН и высокоэнергетической
фосфатной связи. В реакции, катализируемой фосфокиназой, АТФ может
образовываться как из ГТФ, так и из ИТФ. Например: ГТФ+АДФ (ГДФ+АТФ. В альтернативной реакции, протекающей во внепеченочных тканях и
катализируемой сукцинил-СоА-ацетоацетат-СоА-трансферазой, сукцинил-СоА
превращается в сукцинат сопряженно с превращением ацетоацетата в
ацетоацетил-СоА. Впечени имеется диацилазная активность,
обеспечивающая гидролиз части сукцинил-СоА с образованием сукцината и СоА. Далее сукцинат дегидрогенируется, затем присоединяется молекула воды, и
следует еще одна стадия дегидрогенирования, приводящая к регенерации
оксалоацетата: Сукцинат + ФАД ( Фумарат + ФАДН2 Первое дегидрогенирование катализируется сукцинатдегидрогеназой,
связанной с внутренней поверхностью внутренней митохондриальной мембраны.
Это единственная дегидрогеназная реакция ЦТК, в ходе которой осуществляется
прямой перенос с субстрата на флавопротеин без участия НАД+. Фермент
содержит ФАД и железо-серный белок. В результате дегидрогенирования
образуется фумарат. Как показали эксперименты с использованием изотопов,
фермент стереоспецифичен к транс-атомам водорода метиленовых групп
сукцината. Добавление малоната или оксалоацетата ингибирует
сукцинатдегидрогеназу, что приводит к накоплению сукцината. Фумараза (фумаратгидротаза) катализирует присоединение воды к фумарату
с образованием малата: Фумарат +Н2О ( L-малат Фумараза специфична к L-изомеру малата, она катализирует присоединение
компонентов молекулы воды по двойной связи фумарата в транс-конфигурации.
Малатдегидрогеназа катализирует превращение малата в оксалоацетат, реакция
идет с участием НАД+: L-малат + НАД+ ( 0ксалоацетат + НАДН2 Хотя равновесие этой реакции сильно сдвинуто в направлении малата,
реально она протекает в направлении оксалоацетата, поскольку он вместе с
НАДН постоянно потребляется в других реакциях. Ферменты цикла лимонной кислоты, за исключением
альфакетоглутарат- и сукцинатдегидрогеназы, обнаруживаются и вне
митохондрий. Однако некоторые из этих ферментов (например,
малатдегидрогеназа) отличаются от соответствующих митохондриальных
ферментов. Энергетика цикла лимонной кислоты. В результате окисления, катализируемого дегидрогеназами ЦТК, на каждую
катаболизируемую за период одного цикла молекулу ацетил-СоА образуются три молекулы НАДН и одна молекула ФАДН2. Эти восстановительные эквиваленты
передаются в дыхательную цепь, локализованную в митохондриальной мембране.
При прохождении по цепи восстановительные эквиваленты НАДН
генерируют три высокоэнергетические фосфатные связи посредством
образования АТФ из АДФ в процессе окислительного фосфорилирования. За счет
ФАДН2 генерируется только две высокоэнергетические фосфатные связи,
поскольку ФАДН2 переносит восстановительные эквиваленты на кофермент Q и,
следовательно, в обход первого участка цепи окислительного
фосфорилирования в дыхательной цепи. Еще один высокоэнергетический фосфат
генерируется на одном из участков цикла лимонной кислоты, то есть на
субстратном уровне, при превращении сукцинил-СоА в сукцинат. Таким образом, за период каждого цикла образуется 12 новых
высокоэнергетических фосфатных связей. Регуляция цикла лимонной кислоты. Основные процессы, которые поставляют и запасают энергию в клетках,
могут быть в общей форме изображены следующим образом: глюкоза пируват ( ацетил-СоА жирные кислоты AДФ АТФ С02 Регуляция этой системы inter alia должна гарантировать постоянное
поступление АТФ соразмерно с существующими в данный момент энергетическими
потребностями, обеспечивать превращение избытка углеводов в жирные кислоты
через пируват и ацетил-СоА и наряду с этим контролировать экономное
расходование жирных кислот через ацетил-СоА как ключевой продукт для входа
в цикл лимонной кислоты. Цикл лимонной кислоты поставляет электроны в электронпереносящую
систему, в которой поток электронов сопряжен с синтезом АТФ и в меньшей
степени снабжает восстановительными эквивалентами системы биосинтеза
промежуточных продуктов. В принципе цикл не может протекать быстрее, чем
это позволяет использование образуемой АТФ. Если бы весь AДФ клетки
превратился в АТФ , не могло бы быть никакого дальнейшего потока электронов
от НАДH, который накапливается, к 02. Ввиду отсутствия НAД+, необходимого
участника процессов дегидрирования цикла, последний перестал бы
функционировать. Существуют более тонкие регуляторные приспособления,
которые модулируют действие ферментов в самом цикле лимонной кислоты. Сукцинатдегидрогеназа находится во внутренней митохондриальной
мембране. Все остальные ферменты растворены в матриксе, заполняющем
внутреннее пространство митохондрии. Измерения относительных количеств этих
ферментов и концентраций их субстратов в митохондриях указывают, что каждая
реакция протекает с одинаковой скоростью. Как только пируват (или другой
потенциальный источник ацетил-СоА) поступает внутрь матрикса митохондрии,
весь цикл протекает внутри этого отсека. В некоторых участках стимуляция или ингибирование определяется
относительными концентрациями НAДH/НAД, ATФ/AДФ или АМФ, ацетил-СоА/СоА или
сукцинил-СоА/СоА. Когда эти отношения высоки, клетка достаточно обеспечена
энергией и поток через цикл замедлен; когда же они низки, клетка испытывает
потребность в энергии, и поток через цикл ускоряется. Как необратимая реакция, соединяющая метаболизм углеводов с циклом
лимонной кислоты, пируватдегидрогеназная реакция должна хорошо
контролироваться. Это достигается двумя способами. Во-первых, фермент,
который активируется несколькими интермедиаторами гликолиза,
конкурентно ингибируется своими собственными продуктами - НAДH и ацетил-
СоА. При прочих равных условиях увеличение соотношения НAДH/НAД+ от 1 до 3
вызывает 90%-е снижение скорости реакции, а увеличение отношения ацетил-
СоА/СоА приводит к количественно подобному эффекту. Эффект проявляется
мгновенно. Медленнее возникают, но дольше действуют эффекты другого
регуляторного устройства. С сердцевиной каждой молекулы
дигидролипоилтрансацетилазы связано около пяти молекул киназы
пируватдегидрогеназы, которая за счет АТФ катализирует фосфорилирование
серинового остатка в (-цепи пируватдегидрогеназного компонента.
Будучи фосфорилирован, фермент не способен декарбоксилировать пируват. Когда происходит окисление жирных кислот, пируватдегидрогеназа заметно ингибируется. По-видимому, это явление объясняется сопутствующими
процессу окисления высокими концентрациями АТФ, ацетил-СоА и НAДH.
Большинство тканей содержат избыток пируватдегидрогеназы, так что после
приема корма в печени, а также в мышце и в жировой ткани у животных в
состоянии покоя лишь 40, 15 и 10% пируватдегидрогеназы соответственно
находится в активной, нефосфорилированной форме. Когда возрастает
потребность в АТФ, концентрации НAД+, СоА и AДФ возрастают за счет
использования НAДH, ацетил-СоА и АТФ, а киназа инактивируется. Однако
фосфатаза продолжает функционировать вновь активируя дегидрогеназу.
Повышение Са2+ может активировать митохондриальную фосфатазу.
Страницы: 1, 2, 3, 4
|