Біологія Х-вірусу картоплі

Біологія Х-вірусу картоплі

Зміст

Вступ

Розділ 1. Поширеність вірусів рослин та боротьба з ними

Розділ 2. Х-вірус картоплі: характеристика, особливості

2.1 Характеристика вірусу

2.2 Способи передачі вірусу

Розділ 3. Використання Х-вірусу в сучасних дослідженнях

3.1 Метод отримання препаратів Х-вірусу картоплі для виробництва діагностичної сироватки

3.2 Електронномікроскопічні дослідження апікальних меристем картоплі та вплив хіміотерапії на процес оздоровлення

Висновок

Список використаної літератури

Вступ

Віруси не можуть самостійно поширюватись у природі. Допомагають їм у цьому насамперед комахи-переносники (віроформні комахи). Фітопатогенні віруси найчастіше переносять попелиці, трипси, цикади, кліщі й деякі листогризучі комахи. Наприклад, відомо понад 200 видів попелиць — переносників 160 видів вірусів.

Для багатьох вірусів рослин характерний ґрунтовий спосіб поширення, їх поширюють нематоди, які пошкоджують кореневі системи хворих і здорових рослин, а також гриби. Наприклад, гриб ольпідій капустяний може поширювати вірус некрозу тютюну за до­помогою своїх зооспор. Чимало вірусів передається насінням, бульбами, коренями, цибулинами тощо. Виявлено також, що біля 50 вірусів можуть переноситись повитицею, коли цей бур'ян-паразит перекидається з хворої рослини на здорову. Слід додати, що сама людина сприяє поширенню багатьох вірусів. Це відбувається під час проведення різноманітних агротехнічних заходів: щепленні та обрізуванні дерев, пікіруванні розсади, пасинкуванні рослин тощо, коли сік з випадково поранених хворих рослин потрапляє на руки, одяг або знаряддя праці робітників і переноситься у такий спосіб на поранені здорові рослини. Нарешті, віруси звичайної мозаїки квасолі та мозаїки в'яза можуть поширюватись разом з пилком.

Вірусні хвороби рослин спричиняють значні втрати врожаю та зниження якості сільськогосподарської продукції. Необхідність вивчення фітовірусів на Україні визначається, в першу чергу, тим, що більша частина території України – це райони інтенсивного землеробства. Розробка високочутливих та специфічних методів діагностики фітовірусів і ефективних заходів боротьби з ними потребує детального вивчення їх біологічних та структурно-функціональних характеристик. Цінну інформацію щодо структури вірусних білків, організації вірусної частки, деяких функціональних характеристик вірусів рослин можна одержати шляхом вивчення їх антигенної структури. Одним з критеріїв оцінки ступеню спорідненості вірусів рослин є їх антигенні властивості.

Мета роботи полягала в аналізі біології Х-вірусу картоплі та сучасних досліджень, які проводяться з використанням цього вірусу.

Завдання роботи були наступними:

1)           дати коротку характеристику поширеності вірусів рослин та боротьби з ними;

2)           охарактеризувати Х-вірус картоплі та його особливості;

3)           проаналізувати перспективи використання Х-вірусу в сучасних дослідженнях.

Розділ 1. Поширеність вірусів рослин та боротьба за ними

У літературі описано близько 700 вірусних захворювань рослин. Серед збудників цих хвороб добре вивчено понад 150. В Україні зареєстровано понад 115 вірусів рослин. Тривалий час віруси вважались високоспецифічними агентами. Тепер уже відомо, що специфічність їх є досить умовною.

Великої шкоди завдають вірусні хвороби злаковим культурам. В Україні відомо їх понад 10, а всього в літературі описано близько 60 вірусних хвороб злаків. Найбільшої шкоди зерновому господарству завдають смугаста мозаїка пшениці, мозаїка озимої пшениці, штрихувата мозаїка ячменю, мозаїка кукурудзи тощо. Щороку вони призводять до значних втрат урожаю, а в окремі роки, коли спостерігаються масові епіфітотії, втрачаються тисячі тонн зерна.

Останнім часом поширилась і завдає значної шкоди картоплярству України готика картоплі. Характерною ознакою цієї хвороби є розміщення листків під більш гострим кутом до стебла, що надає рослинам готичного вигляду. Вірус готики передається при різанні бульб ножем, під час щеплень, через бульби, комахами тощо. Найбільш уражується готикою картопля в Сумській, Чернівецькій, Полтавській та південних областях України. Зниження урожайності від цієї хвороби сягає подекуди понад 60 %.

Вибір та застосування різних заходів боротьби з вірусними хворобами залежить насамперед від виду хвороби і видів рослин, на які вона поширюється. Загальними для боротьби з вірусними хворобами рослин є такі заходи: 1) виведення і впровадження у виробництво стійких проти вірусів сортів рослин; 2) знищення комах та інших переносників вірусів; 3) ліквідація джерел поширення вірусів у природі (це передусім своєчасне лущення стерні і зяблева оранка, знищення бур'янів на полях, межах, узбіччях доріг, які є джерелом інфекції; дотримання оптимальних строків сівби і проведення противірусного прополювання насіннєвих посівів); 4) використання для сівби здорового безвірусного насінного матеріалу.

Останніми роками серед профілактичних заходів, які запобігають зараженню рослин вірусами, поширення набуває вакцинація рослин (переважно закритого грунту) ослабленими штамами вірусів. Інтенсивно проводяться також роботи з оздоровлення рослин методами термотерапії (з використанням спеціальних термокамер), щоб отримати безвірусні клони, хіміотерапії, культур верхівкових меристем тощо.

Розділ 2. Х-вірус картоплі: характеристика, особливості

2.1 Характеристика вірусу

Збудник: potato X potexvіrus.

Симптоми: хворі рослини мають пригнічений вигляд і погано цвітуть. Краї листків загнуті донизу, листки мають мозаїчне задарвлення.

Х-вірус картоплі (ХВК), типовий представник групи потексвірусів. Міжклітинний транспорт геномної РНК ХВК через плазмодесми клітин рослини-хазяїна забезпечується трьома вірусними транспортними білками: ТБ1, ТБ2 і ТБ3. Для міжклітинного транспорту ХВК необхідний також білок оболонки (БО); однак роль БО і всіх трьох ТБ у міжклітинному транспорті ХВК залишається нез`ясованою.

Рис. 1. Х-вірус картоплі (ХВК), типовий представник групи потексвірусів

Очевидно, геномна РНК ХВК транспортується через плазмодесми у вигляді віріонів або рибонуклеопротеїдів, що містять як БО, так і ТБ1. Відомо, що РНК потексвірусів у складі вірусних часток нетрансльована іn vіtro. У той же час очевидно, що транспортна форма ХВК повинна бути доступна для рибосом для розвитку інфекції.

Інкубація часток ХВК із транспортним білком ТБ1 переводить РНК у складі виріонів з нетрансльованої іn vіtro форми в трансльовану. Результати імуноелектронної мікроскопії преінкубованих препаратів ХВК-ТБ1 свідчать про те, що транспортний білок вибірково зв'язується з одним з кінців вірусної частки (приблизно відповідним 5′-кінцеві вірусної РНК). Можна припустити, що взаємодія з ТБ1 дестабілізує кінець вірусної частки.

Також були отримані результати, що вказують на існування другого способу трансляційної активації віріонної РНК ХВК. Показано, що фосфорилювання білка оболонки ХВК також створює доступну для рибосом іn vіtro РНК у складі вірусних часток.

Приведені вище дані дозволяють припустити існування двох різних механізмів переходу РНК у складі вірусних часток ХВК у трансльовану форму: перший - фосфорилювання БО вихідних віріонів, що попадають у первинно інфіковані клітини, і другий - взаємодія новосинтезованих вірусних часток, призначених для транспорту через плазмодесми, із транспортним білком ТБ1.

2.2 Способи передачі вірусу

У порівнянні з передачею вірусів у польових умовах за допомогою безхребетних або в результаті вегетативного розмноження передача механічним шляхом звичайно відіграє меншу роль. Однак для деяких вірусів цей спосіб передачі має велике практичне значення. Так, віруси можуть поширюватися на плантаціях, легко забруднюючи інструменти, руки й одяг працюючих там людей. Цей спосіб передачі вірусу має особливо велике практичне значення на ранніх етапах росту польових культур, зокрема при висаджуванні рослин. Рослини, інфіковані в ранній період росту, є джерелом поширення вірусу надалі, що відбувається або під час проведення необхідних для даної культури заходів, наприклад видалення бруньок, або в результаті зіткнення хворих і здорових рослин при вітрі. Х-вирус картоплі також легко може передаватися, забруднюючи знаряддя виробництва й обробні машини; передача здійснюється робітниками або тваринами, що раніше контактували з хворими рослинами, причому в деяких випадках вірус може зберігатися в такий спосіб протягом декількох тижнів.

Х-вірус картоплі може передаватися на здорові рослини як у результаті безпосереднього контакту між листками сусідніх рослин, так і в тому випадку, якщо листки таких рослин не контактують один з одним. Припускають, що передача в цьому випадку здійснюється в результаті контакту між коренями сусідніх рослин, однак не можна виключити і можливості того, що визначену роль при цьому грають деякі переносники, що живуть у ґрунті.

Існує ще багато хвороб, що, як уже відомо або як припускають, викликаються якимсь вірусом, однак самі вірусні частки не виділені і не ідентифіковані як инфицирующего агента. У цих випадках, щоб установити вірусну природу якогось визначеного захворювання за допомогою непрямих методів, необхідно насамперед передати захворювання на здорові рослини (часто це приходиться робити за допомогою щеплення, якщо всі інші способи виявляються безуспішними) і потім показати, що це захворювання по викликане клітинними паразитами або іншими агентами невірусної природи. Деякі умови, що можуть стимулювати вірусну інфекцію. Оскільки токсини також можуть передаватися шляхом щеплення, цю операцію, особливо на першому пасажі інфекційного матеріалу, необхідно здійснювати при повній відсутності клітинних паразитів або комах, що повиннео забезпечити елімінацію токсинів як можливої причини захворювання. Так, вірус великих жилок салату-латуку передавався при шести послідовно проведених щепленнях, і при цьому ступінь виразності симптомів не знижувалася. Цей факт виключає можливість того, що симптоми цього захворювання, викликані токсином, продуцируемым.

Міжклітинний транспорт вірусів рослин здійснюється за допомогою одного або декількох вірусспецифічних транспортних білків (ТБ). Саме транспортні білки відіграють ключову роль у переносі вірусного генома усередині інфікованої клітини до плазмодесм, далі в поширенні вірусної інфекції через плазмодесми по клітинах паренхіми і, у випадку деяких вірусів, у транспорті вірусного генома по судинах флоеми. Очевидно, що прогрес у дослідженні вірусних ТБ, їх взаємодій з вірусними нуклеїновими кислотами і різними вірусними і клітинними білками відкриває широкі перспективи для створення нових методів боротьби з вірусними інфекціями рослин.

Розділ 3. Використання Х-вірусу в сучасних дослідженнях

3.1 Метод отримання препаратів Х-вірусу картоплі для виробництва діагностичної сироватки

Х-вірус картоплі (ХВК) є одним з розповсюджених патогенів картоплі в усіх зонах вирощування культури. На Поліссі України спричинювані ним втрати врожаю становлять в середньому 40,8 % [1]. ХВК превалює у посівах в моноінфекції чи в комплексі з іншими мозаїчними вірусами (64 % обстежених зразків) при ступені ураженості сортозразка 5-100% [2]. Контроль насіннєвого матеріалу показує, що у відкритий грунт висаджується здоровий пробірковий матеріал, який у процесі подальшого розмноження зазнає реінфекції: ураженість клонового матеріалу становить 13-57 % залежно від імунологічних характеристик сорту, досягаючи 100 % на окремих сортах.

При аналізі відібраного в полі матеріалу виявляється латентна інфекція в 20-70 % зразків, що вказує на необхідність використання імунологічних методів діагностики вірусу для отримання об'єктивної інформації щодо якості матеріалу в насінницькій, селекційній роботі, ефективності захисних заходів, при вивченні циркуляції вірусу в природних умовах. Біологічні особливості ХВК дають можливість виявляти його у вегетуючих рослинах методом крапельної аглютинації [3] при чутливості методу 1-100 мкг/мл, а також методом імуноферментного аналізу.

Контроль фітопатогенних вірусів потребує методичного забезпечення. Пошук нових методичних підходів при розробці і виробництві засобів діагностики з урахуванням особливостей патогенів спрямований на створення ефективних діагностикумів фітопатогенних вірусів.У представленій роботі ми ставили за мету розробити метод отримання чистих препаратів ХВК для виробництва діагностичної антисироватки.

ХВК накопичували на рослинах томатів сорту Перемога, які вирощували в умовах вегетаційної камери при 20 °С і фотоперіоді 16 годин. Заражали рослини в фазі 3-4 справжніх листків методом механічної інокуляції з попереднім опудрюванням карборундом. Строк максимальної концентрації вірусу в рослинах томату — 21-25 днів після інокуляції.

При розробці методу очищення використовували відомі методики [5-8] та прилад для препаративного електрофорезу [9,10], сконструйований в нашому інституті.

Контроль етапів отримання чистих препаратів проводили з використанням реакції крапельної аглютинації [3] та електронної мікроскопії нативних препаратів, контрастованих 2%-ним розчином фосфорно-вольфрамової кислоти, рН 6,0. Досліджували препарати за допомогою елек-троного мікроскопа Tesla-540 при інструментальному збільшенні 22-30 тис.

Спектри поглинання УФ-світла препаратами МВК реєстрували на однопроменевому спектрофотометрі СФ-46.

Для виділення препарату ХВК листя томатів відбирали на 21-25-й день після зараження.

Проводили інфільтрацію в 0,3 М трис-гліциновому буферному розчині, рН 8,3 з додаванням 0,1 %-ного 2-меркаптоетанолу (ME) та 0,01 М ЕДТА протягом 12 годин за температури +4 °С.

Попередня інфільтрація рослинного матеріалу сприяла підвищенню ефективності екстракції вірусу, блокуючи дію ферментів рослинного соку.

Після інфільтрації листя подрібнювали на вальцевому пресі ПВЛ-1 в присутності 0,3 М трис-гліцинового буфера, рН 8,3 у співвідношенні 1:2. Отриманий гомогенат віджимали через капронове сито. Екстракт в трис-гліциновому буферному розчині містив менше пігменту, ніж при використанні фосфатного чи цитратного буферних розчинів, що значно поліпшувало наступні етапи очистки.

Освітлювали екстракт шляхом центрифугування за 15 000 об/хв протягом 20 хв. До надосадової рідини додавали краплями 20 %-ний розчин тритон Х-100 до кінцевої концентрації 0,5% та інкубували 30 хв., не застосовуючи на цьому етапі органічних розчинників, які різко знижують вихід вірусу [11, 12]. Додавання тритон-Х 100 зумовлює розчинення клітинних мембран і хлоропластів перед осадженням поліетиленгликолем (ТТЕГ).

Первинне концентрування вірусу проводили шляхом додавання до екстракту 20 %-ного розчину поліетиленгліколю (м.в. 40000) та NaCl до кінцевої концентрації 8 % та 1,5 %, відповідно. Витримували 1 годину при температурі +4 °С. Преципітат відділяли центрифугуванням за 6000 об/хв протягом 20 хв.

Після центрифугування при 6000 об/хв в надосадковій рідині вірус серологічно не виявлявся. Для повної екстракції вірусу необхідно було проводити декілька послідовних ресуспендувань осаду 0,01 М трис-гліциновим буфером, рН 8,3, кожен раз освітлюючи екстракт низькошвидкісним центрифугуванням. На цьому етапі загальний об'єм отриманого препарату вірусу не перевищував 1/10 від початкового об'єму рослинного екстракту.

Після осадження ПЕГ екстракція ХВК із преципітата, який містить значну кількість білків рослини-хазяїна, ускладнена. Це потребує застосування ряду циклів екстракції вірусу із осадів та контролю на кожному етапі для уникнення значної втрати вірусу. Екстракція МВК з осадів проходить більш ефективно, якщо для гомогенізації рослинної тканини використовувати трис-гліциновий буфер, а не фосфатний чи цитратний. При використанні трис-гліцинового буфера основна кількість вірусу екстрагується при перших двох етапах ресуспендування.

Остаточне очищення препарату ХВК здійснювали за допомогою приладу для препаративного електрофорезу із застосуванням 40%-ної сахарозної подушки.

При проведені препаративного електрофорезу ХВК необхідно було підібрати оптимальні умови для очищення вірусу: рН та іонну силу буферних розчинів, температурний режим, напругу електричного поля, тривалість, концентрацію сахарозної подушки, кількість антигену; який можна розділити [12].

Сконцентрований осадженням ПЕГ препарат вірусу нашаровували на 40%-у сахарозну подушку висотою 10 см та діаметром 1,5 см, яка була сформована в електрофоретичній колонці.

Електрофорез вели в лужній системі буферів за температури 16-20 °С, сили струму 8-10 мА та напрузі 380-400 в протягом 3 годин.

При відпрацюванні цього етапу отримання препарату МВК виявили, що електрофорез в 40 % сахарозі є ефективним прийомом дляконцентрування ХВК та очищення його від рослинних компонентів.

В роботі ми використовували 0.01М трис-гліциновий буфер, рН 8,3, який найбільше підходить як для екстракції ХВК, так і для електрофорезу. Виходили з того, що буферний розчин, який використовується при електрофорезі, повинен мати низьку іонну силу (0,005-0,02), що дозволяє застосовувати високі градієнти напруги вздовж колонки при мінімальному утворенні тепла. Крім того, мають бути підібрані такі значення рН буферних розчинів, щоб різниця в зарядах між компонентами суміші, яка розділяється, була максимальною [7, 12].

Напругу поля належить підтримувати настільки високою, наскільки можливо за умов мінімального утворення та розсіювання тепла. При розробці нашого методу мінімальний нагрів і конвекцію спостерігали при силі струму 8-10 мА та напрузі 380-400 в.

Важливим фактором при препаративному електрофорезі в 40%-ній сахарозі є температура: якщо охолодження недостатнє, то це призводить до нерівномірного розподілу фракцій.

Експериментальним шляхом визначали тривалість електрофорезу препарату ХВК. Після 1; 2; 3 годин електрофорезу зразки проби та сахарозної подушки перевіряли методами серології та електронної мікроскопії на наявність антигену. Встановлено, що після трьох годин електрофорезу вірус повністю осідав на поверхні пробки ПААГ.

Візуальне спостереження за перебігом електрофорезу показало, що через 30 хвилин після включення струму від зони проби починають відділятися пластівчасті утворення, які осідають на пробці ПААГ, формуючи ледве помітний шар. Вірогідно, це є агрегати ХВК, які утворилися після осадження ПЕГ і можуть містити залишки клітинного дебрису. При застосуванні диференційного центрифугування сконцентрованого ПЕГ препарату віруси, які перебувають в агрегованому стані, неминуче втрачаються [5], внаслідок чого знижується загальний вихід вірусу. За розробленою нами методикою, агрегати ХВК зберігаються саме завдяки відсутності проміжних циклів диференційного центрифугування.

Електрофоретична рухомість агрегатів у 40 %-ній сахарозі за створених нами умов є вищою за рухомість одиничних часток вірусу; можливо, швидкість міграції агрегатів вірусу збільшується за рахунок сили тяжіння.

Після проходження сахарозної подушки частки вірусу та агрегати утворюють шар на поверхні пробки 10 %-ного ПААГ, яка непроникна для ХВК. Тому, залишаючись на поверхні гелю, антиген додатково піддається електродіалізу, завдяки чому відокремлюються низькомолекулярні домішки рослинного походження. Крім того, під час електродіалізу збільшується розчинність агрегатів вірусу. ХВК переходить у фізрозчин у вигляді препарату достатньо високого ступеня чистоти.

Страницы: 1, 2