Использование метода люминесцентной микроскопии в исследовании микроводорослей

Использование метода люминесцентной микроскопии в исследовании микроводорослей

МИНИСТЕРСТВО НАУКИ И ОБРАЗОВАНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ

СИБИРСКИЙ ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

ИНСТИТУТ ФУНДАМЕНТАЛЬНОЙ БИОЛОГИИ И БИОТЕХНОЛОГИИ

КАФЕДРА ФИЗИОЛОГИИ РАСТЕНИЙ И БИОТЕХНОЛОГИИ

Курсовая работа

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДА ЛЮМИНЕСЦЕНТНОЙ МИКРОСКОПИИ В ИССЛЕДОВАНИИ МИКРОВОДОРОСЛЕЙ

студентка III курса

Н.А. Толстоноженко

Красноярск 2008

СОДЕРЖАНИЕ

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1            Явление флуоресценции

1.2            Развитие флуоресцентной микроскопии

1.3            Флуорохромы и флуорохромирование

Глава 2. Объекты и методы исследования

2.1 Объекты флуоресцентной микроскопии

2.2 Возможности флуоресцентной микроскопии

Глава 3. Использование метода люминесцентной микроскопии в исследовании микроводорослей

3.1 Выявление физиологического состояния клеток микроводорослей

3.2 Количественная регистрация интенсивности флуоресценции

3.3 Оценка степени токсичности отдельных веществ для водорослей

3.4 Определение содержания витаминов в растительных клетках

Заключение

Список литературы

Summary

ВВЕДЕНИЕ

Функционирование и роль микроводорослей в различных экосистемах определяется широкими адаптационными способностями, которые включают изменение структурных и физиологических свойств фотосинтетического аппарата.

Изучение модельных систем естественного фитопланктона позволяет решить ряд теоретических проблем в области исследований фотосинтеза, а также имеет практическое значение для прогнозирования развития водорослей при возрастающей антропогенной нагрузке.

Флуоресцентные характеристики фитопланктона используются для оперативного определения концентрации хлорофилла, на основе которой рассчитывается биомасса и продуктивность водорослей. Измерение концентрации хлорофилла позволяет получить сведения о фотосинтетической активности микроводорослей. [14]

В настоящее время метод флуоресцентного анализа выступает в качестве методической основы решения двух крупных проблем: интеграция биологических (растительных) систем и организация мониторинга.

Преимущество люминесцентной микроскопии, как одного из флуоресцентных методов исследования, заключается в том, что информацию о состоянии фотосинтетического аппарата и отдельных клеток можно получить за очень короткий срок при относительно малом объёме проб. [10]

Целью работы является изучение метода люминесцентной микроскопии для исследования состояния микроводорослей.

В задачи работы входило:

1. Ознакомиться с особенностями люминесцентной микроскопии, местом её среди флуоресцентных методов исследования.

2. Изучить методику выявления физиологического состояния и оценки степени токсичности отдельных веществ для клеток микроводорослей с помощью люминесцентной микроскопии.

3. Изучить методику определения содержания нефлуоресцирующих веществ – витаминов – в растительных клетках с помощью исследуемого метода.

4. Изучить методику количественной регистрации интенсивности флуоресценции методом люминесцентного микроскопирования.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Явление флуоресценции

При взаимодействии света с веществом может происходить преломление световых лучей и их рассеяние, либо поглощение фотонов молекулами, или то и другое вместе. Если произошло поглощение кванта света, то через 10-9с может происходить испускание части поглощённой энергии в виде кванта света с большей длиной волны: такое излучение называется люминесценцией. Встречающиеся в природе явления люминесценции весьма разнообразны. [5]

Различают два вида люминесценции, отличающихся по времени жизни и энергии излучаемых фотонов. Исходя из наиболее характерного качественного признака люминесценции – степени её длительности – различают флуоресценцию – свечение мгновенное, появляющееся лишь в момент возбуждения светящегося объекта, и фосфоресценцию – свечение более длительное, продолжающееся иногда весьма долго по окончании возбуждения. Изучение люминесценции позволяет судить о строении поглощающих свет молекул и участков молекул (хромофоров), а также производить их качественный и количественный анализ, выяснять физико-химические свойства среды, окружающей молекулы или их хромофорные группы. [6]

Различают собственную (первичную) люминесценцию, наблюдаемую без окрашивания, и вторичную (наведённую), которая возникает после обработки химическим агентом или красителем. [9]

Согласно закону Стокса, спектр флуоресценции лежит в более длинноволновой области по сравнению со спектром поглощения того же соединения. Это означает, что средняя энергия квантов флуоресценции меньше средней энергии поглощённых квантов.

Правило Каши относится к форме спектра флуоресценции при возбуждении объекта светом разных длин волн. Испускание квантов флуоресценции всегда происходит с нижнего возбуждённого уровня молекул, независимо от того, на каком уровне оказался электрон в результате поглощения. Т.е. какой бы длиной волны не была возбуждена молекула, излучение будет происходить из одного и того же состояния молекулы. [7]

Интенсивность флуоресценции (Iф) зависит от концентрации флуоресцирующих молекул (Z), интенсивности возбуждающего света (Iв), значение молярного коэффициента поглощения (Еλ) и величины квантового выхода флуоресценции

(Кλ): Iф=2,3*Iв* Еλ* Кλ* Z*L,

где L – длина оптического пути в объекте. Измеряемая интенсивность флуоресценции даёт информацию о величине Кλ*Z, т.е. о количестве флуоресцирующих молекул и их способности флуоресцировать (квантовый выход). Это уравнение справедливо при поглощении объектом менее 5% возбуждающего света, что обычно имеет место в физиологических опытах. При поглощении более 5% света наблюдается нелинейная зависимость. [8]

Для характеристики флуоресценции помимо её интенсивности и квантового выхода, можно использовать значения смещения максимума флуоресценции по спектру, время жизни флуоресценции молекулы и степень поляризации флуоресценции. Перечисленные параметры позволяют получить информацию о характере взаимодействия флуоресцентных молекул между собой и с окружающей их средой. [6]

1.2 Развитие флуоресцентной микроскопии

Люминесцентная микроскопия – метод микроскопии, позволяющий наблюдать первичную или вторичную люминесценцию микроорганизмов, клеток, тканей или отдельных структур, входящих в их состав.

Цвет люминесценции, т.е. длина волны излучаемого света зависит от химической структуры и от физико–химического состояния микроскопируемого объекта, что и обуславливает возможность использование люминесцентной микроскопии в целях микробиологической и цитологической диагностики, для дифференцирования отдельных компонентов клеток. Первичная люминесценция присуща ряду биологически активных веществ, таких, как ароматические аминокислоты, порфирины, хлорофилл, витамины А, В2, В1, некоторые антибиотики (тетрациклин) и химиотерапевтические вещества (акрихин, риванол). Вторичная, или наведённая, люминесценция возникает в результате обработки микроскопируемых объектов флюоресцирующими красителями – флюорохромами, что позволяет проводить люминесцентно–цитологический и люминесцентно–цитохимический анализ. [16]

В истории развития люминесцентной микроскопии выделяют несколько этапов, связанных с усовершенствованием методики.

Люминесцентная микроскопия появилась в начале прошлого века как разновидность ультрафиолетовой микроскопии. В 1910 году А. Кёллер доказал принципиальную возможность создания люминесцентного микроскопа. В 1911 г. изобретён люминесцентный микроскоп, который был использован русским ботаником М.С. Цветом для изучения люминесценции хлорофилла растительных клеток. Прогресс люминесцентной микроскопии в дальнейшем был связан с введением в практику флуоресцентных красителей, так называемых флуорохромов, которые были разработаны Хайтингером и его сотрудниками в 1935 году. Применение сильно разбавленных растворов флуорохромов, избирательно связывающихся с определёнными структурами клеток, и прежде всего акридинового оранжевого, было введено Штруггером в 1940 году. Происходило и усовершенствование аппаратуры (разработка метода возбуждения люминесценции падающим светом через объектив микроскопа с использованием интерференционной светоделительной пластинки), разработка новых люминесцентно-цитохимических методов, изысканием новых областей её применения, нашедших широкое применение в микробиологии, иммунологии и других областях медико–биологических исследований.

В настоящее время различают несколько типов люминесцентной микроскопии в зависимости от характера освещения.

При освещении объекта проходящим светом (обычный путь освещения) имеют дело со светопольной люминесцентной микроскопией.

Замена светопольного конденсора конденсором тёмного поля даёт возможность осуществить люминесцентную микроскопию в тёмном поле (люминесцентная ультрамикроскопия).

В случае освещения объекта сверху - имеют дело с люминесцентной микроскопией в падающем (отражённом) свете. [11]

1.3 Флуорохромы и флуорохромирование

У подавляющего большинства биологических объектов их собственная неяркая люминесценция не позволяет проводить люминесцентно-микроскопические исследования и для избирательного выявления определённых структур применяют люминесцентные красители - флуорохромы. Некоторые из этих красителей диффузно распределяются в клетках, другие избирательно связываются с определёнными структурами клеток или даже с определёнными химическими веществами.

Известно несколько десятков органических соединений, с успехом используемых в качестве флуорохромов. К ним относятся красители: тиазоловые, хинолиновые, азокрасители и особенно акриловые производные. Хорошими флуорохромами являются некоторые естественные пигменты (хлорофилл, липохромы), алкалоиды (берберин, хинин), углеводороды (бензпирен, дибензаантрацен). Флуорохромы применяются в сильно разведённых водных или спиртовых растворах (от 1:1000 до 1:100000). Углеводороды (бензипрен) растворяют в насыщенном водном растворе кофеина.

Флуорохромирование проводят либо прижизненно, либо на фиксированных препаратах. Прижизненное флуорохромирование в свою очередь может быть осуществлено или на целом животном или растительном организме (путём инъекции или введения с пищей), или на отдельных тканях и клетках. Прижизненное флуорохромирование особенно полезно при исследованиях функционального состояния и физико-химической характеристики органов, тканей, клеток. [3]

Преимущества флуоресцирующих красителей перед обычными цитологическими или гистологическими реактивами заключается прежде всего в возможности применять флуорохромы в самых минимальных количествах и в очень слабых концентрациях (1:100000 – 1:5000000). Благодаря этому химическое, повреждающее воздействие на клетки сводится до минимума, объект изучается в наиболее физиологических условиях. Относительная безвредность флуорохромирования позволяет так же широко использовать метод прижизненной окраски, имеющий большие преимущества, особенно в цито- и гистофизиологии.

Второе крупное достоинство метода флуорохромирования состоит в быстроте работы. Для проведения исследования обычно требуются доли минуты. Даже самая длительная окраска препаратов занимает максимум 20-30 минут. Расход флуоресцирующих красок из-за больших разведений очень невелик.

Выбор флуорохрома диктуется целью исследования, характером объекта, природой флуоресцирующего вещества, его кислотностью, цветом и др.

По физико-химическим свойствам флуоресцентные красители можно разделить на три группы.

1.                 Щёлочные флуорохромы – характеризуются тем, что находятся в кислой среде в сильно диссоциированном состоянии. Флуоресцирующим компонентом краски является положительно заряженный катион. В сильно щёлочных растворах такие краски находятся в недиссоциированном состоянии.

2.                 Кислые флуорохромы – диссоциируются в щёлочной среде. Флуоресцирующим компонентом краски является отрицательно заряженный анион.

Электронейтральные флуорохромы – слабо кислые или слабо щёлочные краски, диссоциация которых при флуорохромировании не имеет практического значения, поскольку флуоресцирующими свойствами обладает целая молекула. [5]

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Объекты люминесцентной микроскопии

Собственная (первичная) люминесценция присуща только некоторым структурам в исследуемых микроскопических препаратах. Большинство веществ биологического происхождения имеет весьма мало интенсивную голубую, синюю или фиолетовую люминесценцию (максимумы в спектрах люминесценции многих из них лежат в ультрафиолетовой области спектра), поэтому возбуждать люминесценцию биологических объектов необходимо ультрафиолетовым светом, а в качестве «запирающего» светофильтра выбирать такой, который отсекает только ультрафиолет.

Природными люминесцирующими веществами растительной клетки являются хлорофилл, порфирин, фикоэритрин, а также клетчатка, пектин, хитин. Представители разных систематических отделов растений обладают различным набором хлорофиллов и фикобилинов. Диффузное распределение пигментов, специфичное для клеток водорослей, вызывает свечение самих клеток. У высших растений наблюдается свечение пластид. Пигментный состав, а значит и спектральные характеристики, в том числе люминесцентные, одноклеточных водорослей более вариабельны, чем у многоклеточных водорослей и высших растений, и в большей степени зависят от условий обитания, возраста, сезона года и т.д. [1]

Некоторые витамины (А, В2), пигменты (липофусцины, хлорофилл), а так же другие вещества под влиянием более или менее длительного освещения ультрафиолетовым излучением претерпевают фотохимические изменения и перестают люминесцировать. Поэтому микроскопирование таких веществ следует проводить по возможности быстро, часто меняя места наблюдения в исследуемом объекте. [2]

В настоящее время люминесцентная микроскопия находит всё более широкое применение в различных областях научной и практической работы: в вирусологии, гистологии (нормальной и патологической), физиологии, ботанике, онкологии, радиобиологии, а так же при проведении лабораторно-клинических анализов, в санитарных и судебно-медицинских исследованиях. Большой интерес представляет предложенный Кунсом и его сотрудниками исключительно чувствительный люминесцентно-иммунохимический метод меченых антител.

Люминесцентная микроскопия, наряду с другими флуоресцентными методами, применяется в физиологии растений. Часто объектами исследований являются представители растительных сообществ водоёмов: фитопланктона, фитобентоса, фитообрастаний, макрофиты, донные отложения, а также лабораторные культуры водорослей. Например, для тестирования вод различной степени загрязнённости перспективно использовать альгологически чистые культуры зелёных водорослей Scenedesmus quadricauda и Chlorella vulgaris, синезелёной водоросли Microcystis aeruginosa, а так же культуру морской жёлто-зелёной водоросли Phaeodactilum tricornutum. Зелёные и сине-зелёные водоросли повсеместно распространены в водоёмах умеренной зоны, а жёлто-зелёные водоросли широко представлены в морях. [12]

2.2 Возможности флуоресцентной микроскопии

Преимуществами метода флуоресцентной микроскопии является быстрота оценки жизненного состояния клеток водорослей и высших растений без какого-либо их повреждения. Они экономичны по времени и точны, за короткое время можно исследовать большое количество проб на небольшом по объёму материале (например, достаточно 0,5-1,0 мл суспензии водорослей). Особенно удобен метод для экспресс-анализа токсичности различных веществ или сточных вод, а так же для выявления степени загрязнённости различных водоёмов.

Метод хорошо сочетается с биологическими показателями: изменение численности клеток водорослей, видовым разнообразием, даёт быструю и чёткую оценку состояния фитоматериала в целом биоценозе, что позволяет провести биоиндикационную оценку отдельных компонентов биоценоза (фитопланктона, фитобентоса, фитообрастаний, высших растений). Одновременное использование люминесцентной микроскопии и измерения флуоресценции хлорофилла даёт возможность установить первичные поражения растительной клетки, а так же длительность и глубину этого явления и сопровождающие их процессы адаптации при низких концентрациях токсических веществ.

ГЛАВА 3. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДА ЛЮМИНИСЦЕНТНОЙ МИКРОСКОПИИ В ИССЛЕДОВАНИИ МИКРОВОДОРОСЛЕЙ

3.1 Выявление физиологического состояния клеток микроводорослей

Фотосинтетический аппарат растительных организмов весьма чувствителен к действию различных загрязняющих веществ и одним из первых реагирует на их воздействие. Методом люминесцентной микроскопии возможно выявление физиологического состояния клеток микроводорослей на разных этапах автолиза, не уловимого при визуальных наблюдениях, но отчётливо проявляющегося по изменению спектров свечения клеток при люминесценции (определение живых и мёртвых клеток водорослей). Техника использования люминесцентной микроскопии для диагностики физиологического состояния водорослей была разработана С.В. Горюновой. Этот метод основан на том, что при микроскопировании водорослей в ультрафиолетовых лучах клетки, различающиеся по своему физиологическому состоянию, дают различные по окраске и яркости оттенки свечения. [1]

Диатомовые, некоторые зелёные и другие виды водорослей способны к накоплению жира (иногда до 60%). У таких форм процессы распада внешне протекают быстро, то есть клетки теряют характерные контуры с образованием жировых капель, светящихся определённый период ярко-красной люминесценцией. Водоросли, основным составным веществом клетки которых являются специфические углеводы, составляющие иногда до 70% от общего количества органических веществ, как например сине-зелёные водоросли (родов Oscillatoria, Microcystis и др.), имеют длительный период распада, и визуальные наблюдения не отражают изменений окраски водорослей. Такие определения возможны при люминесцентной микроскопии. Живые клетки имеют ярко-красное свечение. Клетки водорослей на различных стадиях отмирания имеют разнообразную гамму световых переходов. В основном изменение спектра свечения клеток водорослей происходит по следующим этапам:

1) Яркое пурпурно-красное свечение характерно для хлорофиллсодержащих клеток наиболее высокой жизнеспособности – клетки находятся в активном состоянии, интенсивно делятся или готовятся к делению (логарифмическая фаза роста).

2) Красное свечение меньшей яркости (тускло-бордовое или розово-красное), присуще клеткам на стационарной фазе роста культуры водорослей.

3) Оранжево-красный оттенок свечения дают клетки, угнетённые под влиянием какого-либо фактора, а бледно-оранжевое свечение имеют клетки с очень низким уровнем жизненной активности, но ещё живые. 4) Тускло-красным светятся старые клетки с ослабленной жизненной активностью.

5) Голубовато-зелёное и оливково-зелёное свечение характерно для мёртвых клеток и детрита, а также нитчатых форм, когда остаются только контуры оболочек. Обычно этот тип свечения свойственен нитчатым формам, встречающимся в иловых отложениях. Синее свечение мёртвых клеток водорослей, остатков высшей водной растительности наблюдается в загрязнённых источниках.

Страницы: 1, 2