Изучение токсического влияния кадмия на активность аминотрансфераз у потомства белых крыс
Изучение токсического влияния кадмия на активность аминотрансфераз у потомства белых крыс
Содержание
Введение
1. Литературный обзор
1.1 Кадмий, как основной источник загрязнения, пути
поступления в окружающую среду и действие на метаболические процессы в
организме
1.2 Роль и структура аспартатаминотрансферазы и
аланинаминотрансферазы
1.2.1 Краткая история открытия реакции переаминирования
1.2.2 Структура аспартатаминотрансферазы
1.2.3 Механизм реакции переаминирования
1.2.4 Биологическая роль трансаминаз
2. Материалы и методы
2.1 Экспериментальная часть
2.1.1 Экспериментальные животные
2.1.2 Подготовка биологического материала
2.1.2.1 Подготовка сыворотки крови
2.1.2.2 Подготовка гомогенатов тканей и органов
2.2 Определение активности аминотрансфераз методом Райтмана
–Френкеля
2.2.1 Ход определения активности аспартатаминотрансферазы и
аланинаминотрансферазы в сыворотке крови
2.2.2 Определение активности аспартатаминотрансферазы и
аланинаминотрансферазы в гомогенатах органов
3. Результаты и обсуждение
Выводы
Список использованных источников
Приложение
СПИСОК СОКРАЩЕННЫХ НАЗВАНИЙ
АСТ – аспартатаминотрансфераза
АЛТ – аланиаминотрансфераза
ПДК – предельно допустимая концентрация
ВОЗ – Всемирная организация здравоохранения
ПОЛ – перекисное окисление липидов
АМ – альвеолярные макрофаги
ПНЛ – полиморфонуклеарные лейкоциты
АТФ – аденозинтрифосфорная кислота
ПЛФ – пиридоксальфосфат
ПМФ – пиридоксаминфосфат
ПВК – пировиноградная кислота
2,4-ДНФГ – 2,4 динтрофенилнидразин
ЦТК – цикл трикарбоновых кислот
АДФ - аденозиндифосфат
Введение
Известно, что тяжелые
металлы обладают выраженными кумулятивными свойствами, высокой биохимической
активностью по отношению к сульфгидрильным, тиоловым, карбоксильным и другим
активным группам белков и аминокислот. Принимая во внимание способность тяжелых
металлов к трансплацентарному переходу и высокую чувствительность организма на
ранних этапах онтогенеза, становиться очевидным, что новорожденные и дети
грудного возраста составляют группу риска развития предпатологических и
патологических состояний/1/.
Кадмий (Cd) является одним из опасных
загрязнителей природной среды. Адсорбируясь через легкие и желудочно-кишечный
тракт, уже через несколько минут он обнаруживается в крови. Кадмий обладает
канцерогенным, гонадотропным, эмбриотропным, мутагенным и нефротоксическим
действием. Реальная угроза неблагоприятного воздействия на население даже при
низких уровнях загрязнения связана с высокой биологической кумуляцией этого
металла. Последствия короткого контакта с высокими концентрациями кадмия в
воздухе приводят к легочному фиброзу, стойкому нарушению легочных и печеночных
функций. В легких оседает до 50% Cd,
попавшего в организм ингаляционным путем. В желудочно-кишечном тракте адсорбция
Cd в среднем состовляет 5%. Органами –
мишенями Cd являются печень, почки, костный
мозг, сперма, трубчатые кости и отчасти селезенка. Кадмий депонируется в печени
и почках, где его содержится до 30% от общего количества в организме/2/.
Токсическое влияние Cd сказывается, прежде всего, на
потомстве, поскольку, проникая через плаценту, кадмий способен изменять ее
ферментативный статус/3/. систем. При введении Cd per os беременным и кормящим крысам, у потомства обнаруживают
повреждения репродуктивной системы и задержке физического развития/4/.
Результатом пренатального и постнатального воздействия Cd является скелетные нарушения, нарушения обмена белков,
липидов, ингибирование ряда ферментативных
Одним из наиболее распространенных
видов биологического действия химических веществ является их способность влиять
на белковый и аминокислотный обмен в организме. Наиболее важными с практической
точки зрения и хорошо изученными ферментами являются аспартатаминотрансфераза и
аланинаминотрансфераза – ферменты, катализирующие межмолекулярный перенос
аминогрупп между амино - и кетокислотами/5/.
Целью данной работы
являлось изучение влияния азотнокислого кадмия на активность
аланинаминотрансферазы и аспартатаминотрансферазы в сыворотке крови и тканях
органов у потомства белых крыс, подвергшихся токсическому действию в
неонатальный период.
В соответствии с целью
были поставлены следующие задачи:
1)
определить
активность АСТ и АЛТ в сыворотке крови, тканях печени, головного мозга, сердца,
почках потомства крыс, подвергшихся хроническому действию ионами кадмия в
период лактации;
2)
изучить влияние
различных доз токсиканта на активность АСТ и АЛТ в сыворотке крови и тканях.
1. Литературный обзор
1.1 Кадмий, как основной источник
загрязнения, пути поступления в окружающую среду и действие на метаболические
процессы в организме
Современный уровень
развития промышленных технологий не позволяет перейти к экологически чистому
производству/6/.Одним из наиболее распространенных загрязнителей окружающей
среды являются ионы тяжелых металлов, в частности кадмий. Индустриальное
загрязнение кадмием характерно для многих промышленных районов России. Кадмий
способен адсорбироваться на твердых частицах и переноситься на большие
расстояния.
Источниками большинства
антропогенных загрязнений являются отходы от металлургических производств, со
сточными водами гальванических производств (после кадмирования), других
производств, в которых применяются кадмийсодержащие стабилизаторы, пигменты,
краски и в результате использования фосфатных удобрений. Кадмий присутствует в
воздухе крупных городов вследствие истирания шин, эрозии некоторых видов
пластмассовых изделий, красок и клеящих материалов /1/. Однако больше всего в
окружающую среду кадмий поступает в виде побочного продукта металлургического
производства (например, при выплавке и электролитической очистке цинка), а
также при хранении и переработке бытовых и промышленных отходов /7/. Даже в
незагрязненных районах с содержанием кадмия в воздухе менее 1 мкг/м, его
ежедневное поступление в организм человека при дыхании составляет около 1% от
допустимой суточной дозы /2/.
Дополнительным источником
поступления кадмия в организм является курение. Одна сигарета содержит 1-2 мкг
кадмия, и около 10% его поступает в органы дыхания. У лиц выкуривающих до 30
сигарет в день, за 40 лет в организме накапливается 13-52 мкг кадмия, что
превышает его количество, поступающее с пищей /7/.
В питьевую воду кадмий
попадает вследствие загрязнения водоисточников производственными сбросами, с
реагентами, используемыми на стадии водоподготовки, а также в результате
миграции из водопроводных конструкций. Доля кадмия, поступающего в организм с
водой, в общей суточной дозе составляет 5-10% /8/. Среднесуточное потребление
кадмия человеком составляет примерно 50 мкг с отдельными отклонениями в
зависимости от индивидуальных и региональных особенностей /2/.Предельно
допустимая концентрация (ПДК) кадмия в атмосферном воздухе составляет 0,3
мкг/м, в воде водоисточников – 0,001мг/л, в почвах песчаных и супесчаных кислых
и нейтральных 0,5, 1,0 и 2,0 мг/ кг соответственно /2/.
Всемирной организацией
здравоохранения (ВОЗ) установлен допустимый уровень содержания кадмия в
организме 6,7- 8 мкг/кг /2,8/. Обмен кадмия в организме характеризуется
следующими основными особенностями/9/: отсутствием эффективного механизма
гомеостатического контроля; длительным удержанием (кумуляцией) в организме. На
задержку кадмия в организме оказывает влияние возраст человека. У детей и
подростков степень его всасывания в 5 раз выше, чем у взрослых /2/. Выведение
кадмия происходит медленно. Период его биологической полужизни в организме
колеблется, по разным оценкам, в пределах 10-47 лет /10,11/. От 50 до 75%
кадмия от попавшего количества удерживается в организме. Основное количество
кадмия из организма выводится с мочой (1-2 мкг /сут) и калом(10-50 мкг/сут)
/2/.
Хроническое воздействие
кадмия на человека приводит к нарушениям почечной функций легочной
недостаточной, остёомаляций, анемий и потери обоняния. Существует данные о возможном
канцерогенном эффекте кадмия и о вероятном участии его в развитии
сердечно-сосудистых заболеваний /12/. Наиболее тяжелой формой хронического
отравления кадмием является болезнь “итай-итай” характеризующаяся деформацией
скелета с заметным уменьшением роста, поясничными болями, болезненным явлениями
в мышцах ног, утиной походкой. Кроме того, отмечаются частные переломы
размягчённых костей, а также нарушение функций поджелудочной железы, изменения
в желудочно-кишечном тракте, гипохромная анемия, дисфункция почек и др./9/.
Кадмий способен накапливаться в организме человека и животных, так как
сравнительно легко усваивается из пищи и воды и проникает в различные органы и
ткани. Токсическое действие металла проявляется уже при очень низких
концентрациях /6/. В современной научной литературе изучению токсического
действия кадмия посвящено немало работ. Наиболее типичным проявлением
отравления кадмием является нарушение процессов поглощения аминокислот, фосфора
и кальция в почках. После прекращения действия кадмия повреждения, вызванные
его действием в почках, остаются необратимыми. Показано, что нарушение
процессов обмена в почках может привести к изменению минерального состава
костей /8/. Известно, что кадмий накапливается преимущественно в корковом слое
почек, а его концентрация в мозговом слое и почечных лоханках значительно ниже
/13/, что связано с его способностью депонироваться в паренхиматозных органах и
медленным выведением из организма.
Предположительно
проявление токсического действия ионов кадмия связано синтезом в организме
белка металиотеонеина, который связывает и транспортирует его в почки. Там
белок почти полностью реадсорбируется и быстро деградирует с освобождением
ионов кадмия, стимулирующих металлиотионеина в клетках эпителия проксимальных канальцев.
Деградация комплекса кадмий-металлиотионеин приводит к повышению уровня ионов
кадмия вначале в лизосомальной фракций, а затем в цитозоле, где происходит
связывание с почечным металлиотионеином. При этом в клетках появляются
везикулы, и повышается число электронно-плотных лизосом, появлением
низкомолекулярной протеинурии и кальцийурией /9,14/.
Роль белка металиотинеина
в снижении токсичности кадмия весьма значительна. Экспериментальное
внутривенное введение кадмия, связанного с данным белком, предотвращает
развитие некроза в почечной ткани у мышей, тогда как аналогичные дозы
неорганического кадмия вызывает развитие некроза в почках. Это доказывает
участие металиотионеина в снижении токсичности металла. Однако этот механизм
ограничен в количественном отношении, потому что при длительном поступлении
кадмия также развивается повреждение тубулярного эпителия /14/.
Многочисленными
исследованиями была показана возможная связь между кадмийиндуцированным
повреждением клеток почек, межклеточным изменением содержания ионов кадмия и
индукцией синтеза стрессовых белков. Первым кандидатом на роль стрессового
белка является кальмодулин, так как in vitro показано,
что кадмий активирует секрецию этого гормона, который через усиление потока
кальция в клетку может повреждать цитоскелет /9/.
Кадмий вызывает развитие
протеинурии, глюкозурии, аминоацидурии и другие патологические процессы. При
длительном поступлении кадмия в организм развивается почечный тубулярный
ацидоз, гиперкальцийурия и формируются камни в мочевом пузыре. В тяжелых
случаях хронической кадмиевой интоксикации может также наблюдаться
нефрокальцидоз. Накопление кадмия в клетках культуры почек происходит
параллельно повышению степени его токсичности. Однако характер распределения
его в клетке не зависит от выраженности цитотоксического действия: более 90%
металла связано с цитозолем, остальная часть – микросомной, митохондриальной,
ядерной фракциями и клеточными фрагментами /8/.
Изучение субклеточного
распределения кадмия в печени позволило расшифровать механизм возникновения
толерантности к данному металлу. Установлено, что снижение чувствительности к
кадмию обусловлено изменением его распределения не в тканях, а цитозольной
субклеточной фракции печени, являющиеся органом – мишенью, где происходит
связывание его с металиотионеином. В дозе 2,4 мг/кг кадмий снижает синтез белка
в микросомальной фракции печени крыс, не нарушая его в ядрах и митохондриях.
Накапливаясь на внутренних мембранах митохондрий, данный металл уменьшает
энергоснабжение и стимулирует перекисное окисление липидов (ПОЛ) при
концентрациях 10 – 100 мкмоль /15,16/.
В первые сутки после
введения кадмия в дозе 4 мг/кг в мышце сердца крыс по сравнению с контролем
увеличились содержание диеновых коньюгантов в 2,1 раз, активность
глутатионпероксидазы – на 3,2%. В коре больших полушарий головного мозга
содержание шиффовых оснований возрастало в 2,2 раза. На седьмые сутки
наблюдения у животных, получавших кадмий, концентрация шиффовых оснований в
неокортексе оставалась повышенной на 59,3%, в сердце – увеличилось в 2,4 раза
по сравнению с контролем; содержание коньюгантов в миокарде в дозе 1 мкмоль
происходит нарушение целостности мембран митохондрий, но стимуляция ПОЛ не
наблюдается /16/.
При хроническом
ингаляционном воздействии кадмий вызывает тяжелые поражения легких. Как
показали проведенные Шоповой В. Л. с сотрудниками исследования /17/, процент
альвеолярных макрофагов (АМ) при воздействии кадмия в первый день значительно
понижался (до 11,5%). Этот эффект наблюдался и на пятнадцатый день – АМ составил
45,5% от исходных значений. Одновременно резко повышался процент
полиморфонуклеарных лейкоцитов (ПНЛ), среди некоторых встречались и незрелые
формы. Средняя площадь АМ после химического воздействия увеличивалась за счет
повышения процента очень крупных клеток, а не за счет равномерного увеличения
площади всех клеток. При этом крупные АМ имели вакуолизированную пенистую
цитоплазму. Встречались и клетки с пикнотическими ядрами, кариолизисом и
кариорексисом. Все это указывает на то, что соединения кадмия существенно
понижают содержание внутриклеточного АТФ и ингибируют клеточное дыхание.
В основе механизма
токсического действия ионов тяжелых металлов, в том числе кадмия, лежит их
взаимодействие с компонентами клеток, молекулами клеточных органелл и мембран.
Ионы металлов могут
влиять на процессы, протекающие в клетке, только проникая внутрь ее и
фиксируясь в субклеточных мембранах. Кадмий проникает в клетку через потенциал
зависимые кальциевые канальцы. Воздействие кадмия на внутриклеточные процессы
весьма разнообразны. Так, металл оказывает заметное влияние на обмен
нуклеиновых кислот и белка. Он ингибирует in vivo включение тимидина в ДНК регенерирующей печени,
угнетает синтез белка в печени крыс на стадии инициации трансляции, нарушая
образования полирибосом, тогда как процесс элонгации, напротив, ускоряется в
результате активирования факторов EF – 1 и EF – 2 /9/. Избыток ионов кадмия
ингибирует синтез ДНК, белков и нуклеиновых кислот, влияет на активность
ферментов, нарушает усвоение и обмен ряда микроэлементов (Zn, Cu, Se, Fe), что может вызывать их дефицит.
Следует заметить, что при достаточном поступлении цинка в организм токсичность
кадмия снижается/8/.
С помощью электронной
микроскопии было установлено, что кадмий вызывает ультраструктурные изменения
клеточных мембран, митохондрий, цистерн аппарата Гольджи, сети трубочек,
хроматина, ядрышка, микрофиламентов и рибосом/18/.
Поражение клеточной
оболочки является наиболее ранним признаком действия данного металла, особенно
при длительном поступлении, хотя клетки могли переносить поражения клеточной
оболочки, а также митохондрий и в некоторой степени – аппарата Гольджи/16/.
При исследовании
воздействия кадмия in vitro на митохондриальную мембрану
выявили, что ионы кадмия повышают проницаемость мембраны к ионам H, K, Mg, а это приводит
к активации дыхания энергизованных нефосфорилирующих митохондрий/15/.
Известно, что некоторые
ферменты в своей структуре имеют ионы металлов. Существует группа ферментов, в
состав простетической части которых входят ионы металлов IV периода таблицы химических
элементов, которые способны замещаться на любой двухвалентный ион металла
(близкий по положению в таблице Д. И. Менделеева) /12/, в частности, к таким
ферментам относятся щелочная фосфатаза и ряд протеаз /19/. На основании проведенных
экспериментов можно предположить, что в результате замещения ионов в
простетической части фермента один на другой происходит изменение
пространственной конфигурации активного центра фермента, что приводит к
изменению уровня его активности.
Свое токсическое влияние
кадмий оказывает и на репродуктивные функции организма /20/. Эффект зависит от
дозы вещества и времени воздействия. Основываясь на экспериментальных данных,
полагают, что тератогенное действие кадмийсодержащих веществ может быть связано
с ингибированием активности карбоангидразы /16/. Так, воздействуя на ткани
семенников, кадмий вызывает уменьшение синтеза тестостерона /20/. Данный металл
может приводить к гормональным нарушениям у самок, предотвращает
оплодотворение, может вызывать кровотечения и даже приводить к смерти
эмбрионов/9,21/. Установлено также, что кадмий способен накапливаться в
плаценте и вызывать ее повреждение /7/. В исследованиях /9,21/ было выяснено
влияние различных доз кадмия на эмбриональную смертность. Так, при введении
металла в дозе 5 мг/кг впервые обнаруживаются мертвые эмбрионы, при 10 мг/кг
наблюдается снижение средней массы плода, увеличение эмбриональной смертности в
2,8 раза, а при дозе 20 мг/кг – максимальное число мертвых эмбрионов на одно
животное/20,22/.
В литературе описано
также отдаленное воздействие кадмия на развитие потомства. В частности, в
результате введения самкам раствора кадмия во время беременности и в период
лактации, у потомства, подвергавшегося действию металла в эмбриогенезе,
наблюдались нейрохимические изменения в мозжечке и в полосатом теле, и
изменения моторной активности во взрослом состоянии/23/.
Таким образом,
основываясь на литературных данных, можно отметить, что токсичность соединений
кадмия следует рассматривать двояко. С одной стороны – это непосредственное
действие ионов на организм. С другой стороны – влияние на потомство особей,
подвергшихся действию соединений этого тяжелого металла.
1.2 Роль и структура
аспартатаминотрансферазы и аланинаминотрансферазы
1.2.1 Краткая история открытия
реакции переаминирования аминокислот
Реакция переаминирования
аминокислот была открыта учёными А.Е.Браунштейном и М.Г. Крицман в 1937 году
при изучении дезаминирования глутаминовой кислоты в мышечной ткани /24/. Было
замечено, что при добавлении к гомогенату мышц глутаминовой и пировиноградной
кислот образуется L-кетоглутаровая
кислота и аланин без промежуточного образования аммиака; добавление аланина и - кетоглутаровой кислоты приводило к
образованию пировиноградной и глутаминовой кислот. В последующих исследования
было показано, что реакции переаминирования широко распространены в живой
природе и играют важную роль в сопряжении азотистого и энергетического обмена
/25/.
Реакции переаминирования
протекают при участии специфических ферментов, названых А.Е. Браунштейном
аминоферазами (или по современной классификации, трансаминазами). Теоретически
эти реакции возможны между любой амино - и кетокислотой, но наиболее интенсивно
они протекают в том случае, когда один из партнеров представлен дикарбоновой
амино - или кетокислотой. В тканях животных и у микроорганизмов доказано
существование реакции переаминирования также между монокарбоновыми амино - и
кетокислотами/26/.
Страницы: 1, 2, 3
|