МЕНЮ


Фестивали и конкурсы
Семинары
Издания
О МОДНТ
Приглашения
Поздравляем

НАУЧНЫЕ РАБОТЫ


  • Инновационный менеджмент
  • Инвестиции
  • ИГП
  • Земельное право
  • Журналистика
  • Жилищное право
  • Радиоэлектроника
  • Психология
  • Программирование и комп-ры
  • Предпринимательство
  • Право
  • Политология
  • Полиграфия
  • Педагогика
  • Оккультизм и уфология
  • Начертательная геометрия
  • Бухучет управленчучет
  • Биология
  • Бизнес-план
  • Безопасность жизнедеятельности
  • Банковское дело
  • АХД экпред финансы предприятий
  • Аудит
  • Ветеринария
  • Валютные отношения
  • Бухгалтерский учет и аудит
  • Ботаника и сельское хозяйство
  • Биржевое дело
  • Банковское дело
  • Астрономия
  • Архитектура
  • Арбитражный процесс
  • Безопасность жизнедеятельности
  • Административное право
  • Авиация и космонавтика
  • Кулинария
  • Наука и техника
  • Криминология
  • Криминалистика
  • Косметология
  • Коммуникации и связь
  • Кибернетика
  • Исторические личности
  • Информатика
  • Инвестиции
  • по Зоология
  • Журналистика
  • Карта сайта
  • Культивирование бактерий


    Турбидиметрия.

    Размеры бактериальных клеток относятся к тому же порядку величин, что и длины волн видимого света, поэтому бактериальные суспензии довольно значительно рассеивают свет, т. е. имеют мутность. Величину светорассеяния можно измерить с помощью спектрофотометра. Этот прибор позволяет определить долю падающего света, которая при его прохождении через пробу теряется в результате рассеяния и поглощения света. Для измерений используют кюветы одной и той же толщины, чтобы можно было сравнивать результаты. Поглощение связано с интенсивностью падающего (Iо) и пропускаемого (I) света зависимостью А = 1оg(Iо/I). Соотношение между концентрацией раствора и поглощением, известное как закон Ламберта-Бэра, А = е • с • d, применимо в строгом смысле только к не рассеивающим свет растворам. Тем не менее существует линейная зависимость между «поглощением» (А) и количеством клеток бактерий в суспензии N : А = (d • N) в диапазоне величин А < 0,3. Обычно для измерения роста используют длины волны от 500 до 660 нм, поскольку большинство компонентов клеток не поглощает свет этой области спектра (длину волны указывают нижним индексом, например, А660)  Показания прибора за вычетом величины поглощения кюветы с чистой средой (контроль) называют оптической плотностью, ОD (при толщине кюветы 1 см), или единицами Клетта («Klett  Units») при использовании фотометра типа Klett Summerson из культур с высокой плотностью клеток перед измерением поглощения разводят.

    Светорассеяние зависит не только от количества частиц в суспензии, но также от их размеров и формы. Тем не менее, разбавленные суспензии большинства бактерий независимо от размеров клеток характеризуются почти одинаковым поглощением в расчете на концентрацию сухого вещества. Для перевода показаний спектрофотометра в значения биомассы используют калибровочную кривую, показывающую зависимость оптической плотности культуры от концентрации биомассы (высушенных клеток). Таким образом, Турбидиметрия служит высокоточным и удобным методом непрямого определения биомассы. Однако следует учитывать, что величины поглощения света суспензиями отдельных бактерий с клетками разных размеров могут быть различными.

    Реже для определения биомассы используют нефелометрию —- измерение светорассеяния под углом 90 ° к падающему пучку света. Обратите внимание, однако, что большая часть света рассеивается лишь на небольшой угол, 2-12 °. Это высокочувствительный метод, но он может давать ошибочные результаты при наличии в среде примесей в виде частиц. Для точности измерений нефелометр необходимо часто калибровать.




    Определение биомассы.

    Турбидиметрия как способ определения биомассы в ряде случаев

    неприменима (для культур с мицелиальным или поверхностным ростом, для бактерий, образующих длинные нити, агрегаты и скопления клеток, а также для смешанных культур, в которых варьирует количественное соотношение видов); измерение количества сырой биомассы дает обычно весьма неточные результаты. В связи с этим для измерения биомассы определяют массу высушенных клеток. Отцентрифугированную (или отфильтрованную) и промытую водой биомассу высушивают до постоянного веса в сушильном шкафу при 105 °С. Другим способом сушки служит лиофилизация. Сухое вещество клеток составляет обычно 10-20% их сырой массы. Количество биомассы можно также оценить косвенно по содержанию белка в культуре. Для этого клетки осаждают кислотой, после чего определяют белок с помощью колориметрического метода. Соотношение биомассы клеток и количества в ней белка постоянно только при, сбалансированном росте, т. е. когда состав клеток по мере роста культуры не претерпевает изменений. Однако в большинстве случаев это соотношение изменяется в конце экспоненциальной фазы роста, а также при образовании бактериями большого количества запасных веществ. Способом измерения роста может также служить определение содержания С или N в биомассе.


    Метаболические параметры, пропорциональные росту.

    Если рост культуры относительно сбалансированный и метаболизм не разобщен с биосинтезом, увеличение биомассы удобно контролировать по поглощению субстратов (например, О2 или источника углерода) либо по образованию продуктов обмена (например, СО2). Концентрацию газов наиболее просто определить на входе и выходе культиватора с помощью масс-спектрометра, инфракрасного абсорбционного спектроскопа или другого прибора. Зная экономический коэффициент (отношение массы клеток к количеству потребленного субстрата) и метаболические параметры роста, можно оценить увеличение биомассы.


    3.6.Подсчет колоний.

    Этот широко применяемый метод позволяет определять количество жизнеспособных клеток, образующих на плотной среде видимые колонии. На получаемые результаты может, однако, влиять изменение в состоянии клеток при инкубации в новых условиях и, кроме того, при использовании этого метода могут оказаться неучтенными покоящиеся формы бактерий. Как правило, перед посевом готовят серийные разведения культуры, например в физиологическом растворе, содержащем фосфатный буфер. Если культура густая, делают несколько 10- или 100-кратных разведений, поскольку количество жизнеспособных клеток в пробе заранее не известно. Напротив, разбавленные пробы, например из природных водоемов, содержащие незначительное число бактерий, концентрируют фильтрованием или иногда центрифугированием. Посев производят поверхностным или глубинным способом. При поверхностном посеве инокулят в виде суспензии клеток объемом 0,1 мл наносят на поверхность застывшей агаровой среды. При глубинном посеве вносят 0,1-1,0 мл инокулята в еще не застывшую среду, после чего ее перемешивают и разливают по чашкам Петри (предполагается, что кратковременное пребывание клеток в расплавленной агаровой среде, при 45 °С не влияет на их жизнеспособность, но это необходимо проверять). Анаэробные бактерии, для подсчета клеток выращивают во вращаемых пробирках: пробирки с небольшим количеством расплавленной агаризованной среды, закрытые пробками, вращают в горизонтальном положении на холоду, в результате чего агар застывает в виде тонкой пленки на стенках пробирки. Другой способ учета анаэробных бактерий —это посев в двухслойный агар; бактерии высевают на агаризованную среду в чашках Петри и поверх нее наносят тонкий слой полужидкого агара. Развитие небольших, компактных колоний происходит под его поверхностью. Для анаэробов используют также посев в тонкий слой агара: инокулят вносят в небольшое количество расплавленного и остуженного полужидкого агара (0,75%), который выливают затем в чашку Петри с плотной средой. Подсчет колоний производят обычно в тех чашках (или вращаемых пробирках), в которых содержится от 30 до 300 колоний. Для достоверности результатов необходимо подсчитать несколько сотен колоний. При статистической обработке данных определяют стандартное отклонение как квадратный корень числа подсчитанных колоний. Каждый из этих методов предполагает контроль эффективности посева с помощью прямого подсчета числа клеток (см. ниже); эта эффективность должна быть близка к 100%. Кроме того, следует проверять, что клетки в инокуляте не образуют скоплений. Результаты количественного учета клеток

    обычно выражают в колониеобразующих единицах.

    Для определения численности бактерий в сильно разбавленных пробах (например, питьевой воде) рекомендуется использовать метод подсчета колоний на мембранных фильтрах. Пробы фильтруют через мембранные фильтры с необходимыми размерами пор, после чего фильтр помещают на агаризованную среду или просто на фильтровальную бумагу, пропитанную питательной средой. Колонии образуются на поверхности фильтра благодаря проникновению через него питательных веществ из среды. Недостаток всех описанных методов состоит в том, что многие бактерии могут быть высокочувствительными к некоторым компонентам агара. Посев для подсчета колоний можно объединить с физиологическими тестами, используя индикаторный агар.

    3.7.Метод определения наиболее вероятного числа бактерий (метод предельных разведений).

     Этот способ позволяет провести грубый подсчет числа жизнеспособных клеток. Он состоит в том, что приготавливают несколько последовательных разведений культуры в ростовой среде и после инкубации подсчитывают число пробирок, в которых отсутствует рост. Предполагается, что в эти пробирки при посеве не было внесено ни одной жизнеспособной клетки. Принимая, что распределение клеток описывается формулой Пуассона, среднее число клеток т в данном разведении вычисляют по формуле

    т = -1пР0, (6.11)

    где ро — отношение количества пробирок, в которых отсутствует рост, к общему числу пробирок в данном разведении. Затем среднее значение умножают на фактор разбавления и корректируют с учетом объема инокулята, чтобы вычислить число жизнеспособных клеток в исходной культуре. Этот метод более трудоемок по сравнению с методами прямого подсчета, но его приходится использовать, если микроорганизм не растет на плотных средах. Кроме того, он позволяет учесть организмы, растущие медленнее других, если они находятся в одной пробе с быстрорастущими формами. Наиболее важное преимущество этого метода состоит в том, что в тех образцах, где, помимо исследуемых, присутствуют иные организмы, он позволяет выявить интересующий объект, например с помощью микроскопии или по образованию характерных продуктов (например, сероводорода бактериями сульфатредукторами; в присутствии Н2S и Fе(П) образуется черный осадок FеS). Кроме того, можно исключить контаминирующие бактерии, применяя селективные среды.


    Прямой подсчет.

     Количество микробных клеток можно подсчитывать непосредственно под микроскопом с помощью счетной камеры, представляющей собой специальное предметное стекло с небольшой выемкой известной глубины (обычно 0,02 мм) и нанесенной сеткой из небольших квадратов известной площади. Выемку заполняют исследуемой суспензией бактерий, и плотно закрывают камеру притертым прочным покровным стеклом, после чего подсчитывают количество бактерий в этом определенном объеме суспензии. Для прямого подсчета под микроскопом можно использовать также мембранные фильтры, окрашивая осажденные на них бактерии. При этом на высушенные фильтры наносят иммерсионное масло, благодаря чему они становятся прозрачными. Этот метод полезен для тех случаев, корда образец содержит менее 106 клеток/мл. Другим способом концентрирования проб может быть центрифугирование. Для подсчета бактериальных клеток весьма удобен электронный счетчик частиц (счетчик Коултера), позволяющий определять, помимо числа клеток распределение их по размерам.

    В природных условиях измерять рост бактерий довольно сложно. Обычно для этого используют косвенные методы, такие как определение фиксации 14СО2 или [3Н]-тимидина. Кроме того, проводят прямой подсчет числа клеток с использованием флуоресцентного микроскопа, окрашивая клетки флуоресцентными красителями (например, 4',6-диамидино-2-фенилиндолом, ДАФИ) или обрабатывая их флуоресцентными ДНК-зондами.


      4.0. Методы хранения культур обеспечивают

    длительное поддержание их жизнеспособности

    Основные цели хранения культур — это поддержание жизнеспособности клеток и чистоты культуры, а также предотвращение изменений и мутаций, т. е. сохранение микроорганизма в максимально близком к исходному штамму состоянии. Для хранения важен правильный выбор среды и метода культивирования, а также возраста культуры на момент начала хранения.

    Методы непродолжительного хранения лишь частично удовлетворяют этим критериям. Из таких методов чаще всего применяется периодический пересев культур на свежую среду с выращиванием при низкой температуре и последующим хранением в холодильнике. Культуры споровых бактерий, содержащие зрелые споры, можно хранить сухими в стерильной почве, на стерильной фильтровальной бумаге или в виде культур, высушенных при помощи силикагеля. Некоторые бактерии хорошо переносят хранение в высушенных каплях желатина. Для многих целей хранят клетки в жизнеспособном состоянии в течение лет при температуре —20 °С или, что лучше, при —70 °С (глубокое замораживание). Для хранения с помощью этих методов необходимо использовать культуры в середине или в конце экспоненциальной фазы роста, сконцентрированные и затем ресуспендированные в небольшом количестве свежей питательной среды. При замораживании в среде должны присутствовать криопротекторы, такие как глицерол (15-40 об. %) или диметилсульфоксид (ДМСО, 5-10 об. %), предохраняющие клетки от повреждения замораживанием, которое должно происходить со скоростью 1 °С/мин. Оттаивание замороженных культур рекомендуется производить в более быстром режиме.

    В настоящее время широко применяются методы длительного хранения, основанные на лиофилизации или ультразамораживании культур в жидком азоте (—196 °С) либо над жидким азотом (—150 °С). Для оценки эффективности этих методов их сравнивают по доле выживших клеток после определенного времени хранения. Ожидаемый период выживания бактерий при обоих способах длительного хранения превышает 40 лет, в то время как при глубоком замораживании он составляет 1-3 года. При ультра-замораживании к суспензии обычно добавляют криопротекторы, такие как глицерол (10 об. %) или ДМСО (5 об. %). Эти соединения водорастворимы и способны легко проходить через клеточную мембрану, имеют низкую точку плавления и могут замещать воду в качестве гидратной оболочки, уменьшая таким образом повреждающее влияние дегидратации при замерзании воды. Поэтому замораживание и образование кристаллов льда в среде протекает замедленно. Происходящее при этом возрастание концентрации внеклеточного раствора приводит к тому, что вода начинает выходить из клеток. По мере замораживания вся свободная вода кристаллизуется (в виде чистого льда), оставляя концентрированный раствор, замерзание которого приводит к образованию лишь незначительного количества повреждающих клетку кристаллов.

    Лиофилизация заключается в удалении воды из замороженных клеток путем сублимации при низком давлении; при этом вода испаряется без перехода в жидкую фазу. Лиофильно высушенные клетки сохраняют жизнеспособность в течение длительного времени, если защищены от действия кислорода, влаги, высокой температуры и света. При лиофилизации к суспензии часто добавляют криопротекторы, такие, например, как молочная сыворотка (20%, вес/объем), лошадиная сыворотка (10 об. %), сахароза (12%, вес/объем) или другие химические вещества.


    4.1.Работа микробиологов основана на методах

    элективного культивирования и получения чистых культур


    До сих пор мы рассматривали методы выращивания и поддержания имеющихся культур бактерий. Однако для решения многих проблем научного и прикладного характера необходимы поиск в природе и выделение новых видов с ранее не описанными свойствами. При этом используют метод накопительных культур, введенный в практику более 100 лет назад С. Н. Виноградским и М. Бейеринком.

    Принцип методов выделения.

     В большинстве природных образцов в одном грамме материала присутствуют сотни различных видов бактерий, и тем не менее среди них можно не найти искомого. Чтобы выделить желаемый микроорганизм, важно иметь подходящий материал из соответствующего местообитания. Например, экстремально термофильные бактерии с большой вероятностью можно выделить из воды горячих источников, анаэробные — из иловых отложений. В природе происходит естественное обогащение сред теми или иными микроорганизмами, если имеется постоянный приток специфического субстрата и относительно постоянные условия, По аналогии с этим метод накопительных культур основан на подборе селективной (элективной) среды — благоприятной для искомого организма и неблагоприятной для других, а также селективных физико-химических условий культивирования. К сожалению, при использовании такого метода в накопительной культуре, как правило, доминируют быстрорастущие виды, которые подавляют все остальные формы. Медленнорастущие виды удается выделить только в том случае, если своевременно пересевать пробы из накопительной культуры на плотную среду в чашках Петри. Можно также высевать непосредственно природные пробы на плотную элективную среду, где медленнорастущие виды при длительной инкубации образуют видимые колонии.

    Селективные условия создают путем комбинирования различных источников энергии, углерода и других элементов (N, Р, S и т. д.) плюс доноров и акцепторов электронов, путем внесения в среду ингибиторов, варьирования освещенности, концентрации кислорода, температуры, рН, активности воды, солености и т. д., а также концентрации компонентов среды и спектрального состава света.

    Чистые культуры, или клоны, получаемые из одной клетки, выделяют в большинстве случаев с помощью методов, описанных в разд. 6.5 как способы измерения роста путем подсчета колоний. Простейший способ получения колоний — это посев проб из накопительной культуры на поверхность плотной питательной среды истощающим штрихом или в расплавленную и остуженную агаризованную среду, разливаемую затем в чашки Петри либо пробирки. Среди выросших колоний выбирают полностью изолированные от других и тем же способом высевают их в виде суспензии на аналогичную среду. Если все колонии из второго пересева выглядят одинаково, их можно использовать далее для посева в жидкую среду (при этом также нужно брать изолированную колонию). Однако бактерии, способные к быстрому движению, в особенности спирохеты, могут легко распространяться по влажной поверхности среды и контаминировать чашку. Другой способ выделения — это последовательное разведение клеточной суспензии питательной средой в соотношении 1 : 2 (или 1 : 10, 1 : 100; метод предельных разведений), с тем допущением, что последнее из разведений, где будет наблюдаться рост, исходно содержало лишь одну бактериальную клетку. Этот метод используют, если выделяемый организм количественно преобладает в накопительной культуре. В случаях, когда нельзя использовать ни высев на плотные среды, ни разведение пробы в жидкой среде, чистую культуру можно получить из отдельной бактериальной клетки, отобранной под микроскопом с помощью капиллярной пипетки и микроманипулятора. Все этапы выделения необходимо производить в нескольких повторностях и проверять чистоту выделенных колоний или культур по всем необходимым критериям.


    Непрерывное культивирование служит ценным инструментом исследования


    Рост в хемостате.

    Скорость роста бактерий может изменяться в соответствии с условиями и составом среды, например в ответ на сдвиг в концентрации субстрата. Это свойство бактерий наглядно иллюстрирует хемостатная (непрерывная) культура. При непрерывном культивировании, в отличие от периодического, в культиватор постоянно подается свежая питательная среда и концентрация одного из субстратов поддерживается на уровне, лимитирующем рост. Одновременно происходит постоянный отток культуры, так что объем ее в культиваторе не изменяется. Культиватор снабжен мешалкой для равномерного распределения свежей среды.

    Хемостатная культура обладает двумя неожиданными свойствами. Во-первых, при постоянном притоке свежей среды плотность клеток в ней сохраняется на постоянном уровне, и, во-вторых, стационарная концентрация клеток N остается практически неизменной даже при больших изменениях скорости протока (Е; размерность объем/ед. времени, например л/ч). Однако при скорости протока выше определенного значения стационарная концентрация клеток начинает резко падать, достигая нуля при критической скорости протока, соответствующей максимальной удельной скорости роста мах периодической культуры того же организма. Остаточная концентрация субстрата в культуре обычно очень низка, но возрастает гиперболически с увеличением скорости протока, пропорционально падению концентрации клеток.


    -  Культивирование в хемостате.

    -   обеспечивает постоянное получение молодых клеток, выросших в строго определенных условиях при известной удельной скорости роста; такие клетки необходимы для изучения различных регуляторных процессов;

    -   позволяет определять важные показатели роста, такие как Кs, /mах, ms и любые другие, связанные с , а также изучать физиологическую реакцию культуры на лимитирование питательными веществами;

    -   служит полезной моделью для описания роста во многих природных местообитаниях;

    -   позволяет выявлять предпочтительно используемые субстраты в их смеси, а также конкуренцию или сосуществование двух или трех видов при данных условиях роста;

    -   позволяет проводить подпитку токсичными субстратами в более высоких концентрациях;

    -   обеспечивает отбор мутантов с более низким значением Кs лимитирующего рост субстрата или более высоким значением mах;

    -   позволяет исследовать стабильные двухкомпонентные культуры, также как синтрофные ассоциации, или, например, простейших, питающихся бактериями.


    4.2.Полунепрерывное культивирование

    Этот способ культивирования, называемый также периодическим культивированием с подпиткой, состоит в том, что в периодическую культуру непрерывно добавляют основной питательный субстрат, экспоненциально увеличивая скорость его подачи. Таким путем удлиняют экспоненциальную фазу роста, чтобы можно было периодически отбирать часть культуры для ее использования. Полунепрерывное культивирование применяют, например, в тех случаях, когда субстрат в высоких концентрациях токсичен. При таком способе удается получать больший урожай клеток или выход продукта, чем при обычном периодическом культивировании, и для этого не требуется много Дополнительного оборудования. Таким образом, обеспечивая культуру основными питательными веществами в возрастающем количестве соответственно ростовым потребностям микроорганизма, но не создавая их избытка, в периодической культуре удается достичь очень высокой плотности клеток (до 150 г сухого вещества биомассы/л). Если биомассу необходимо использовать в качестве биокатализатора, ее можно возвращать в культиватор после отделения от среды (обратная связь через биомассу). Когда исследователей интересует продукт, а не клетки, полезным методом может служить диализное культивирование, при котором культура, находящаяся в специальном сосуде, сообщается через диализную мембрану с рециркулирующей средой, из которой постоянно удаляются продукты обмена. Мембрана легко проницаема для питательных веществ и продуктов обмена, но не для клеток. К преимуществам диализной культуры относятся: 1) возможность достижения очень высокой плотности клеток; 2) ослабление ингибирования продуктом и отделение метаболитов от клеток; 3) возможность изучения чистых культур в природных средах и 4) возможность изучения взаимодействия между двумя чистыми культурами.


    4.3.Методы консервирования основаны на подавлении микробного роста

    Физические факторы.

     Любой фактор, влияющий на скорость роста бактерий, при его экстремальном уровне оказывает ингибирующее действие (исключение составляет случай экстремофилов, способных выживать в таких условиях). На практике подобного рода воздействия позволяют консервировать любые органические материалы, например продукты питания, и предотвращать их порчу патогенными, гнилостными или токсинобразующими микроорганизмами. Физические методы обработки включают прогревание или замораживание, подкисление, высушивание, засолку или добавление большого количества сахара для понижения доступности воды. Неблагоприятный эффект экстремальных температур, значений рН или осмолярности повышается при удалении из среды кислорода. На применении этих факторов основаны традиционные методы консервирования продуктов питания.

    Химическая обработка.

     В качестве ингибиторов роста микроорганизмов могут применяться некоторые безопасные для человека химические вещества в низких концентрациях. Например, при добавлении газообразного SО2 в воду образуется сернистая кислота (Н2SОз; рК1 = 2; рК2 = 7), которая в протонированной форме проникает через клеточную мембрану и как восстановитель (окисляясь до Н2SО4) расщепляет —S—S-связи с образованием —S—SО3- +НS-. Это позволяет использовать SС2 для консервирования кислых продуктов, таких как вино или сухие фрукты, если их рН < 3,5-4. Бактериальный рост может быть предотвращен добавлением слабых органических кислот или их образованием микробами in situ, если значение рН среды поддерживается на низком уровне. Последнее необходимо для того, чтобы кислоты преимущественно находились в протонированной форме, способной проникать сквозь клеточную мембрану. В качестве таких ингибиторов используют молочную, муравьиную, пропионовую, лимонную, виннокаменную, бензойную и сорбиновую кислоты. Эфиры бензойной кислоты легко проникают через мембрану при нейтральном рН и внутри клеток расщепляются эстеразами. Благодаря этому они используются как добавки для консервирования продуктов питания, имеющих нейтральную или щелочную реакцию. Если не исключен доступ воздуха, консервируемые кислотами продукты могут портиться под действием дрожжей и грибов. Этиловый спирт при высоком содержании также предотвращает микробный рост. Такие обладающие антимикробным действием соединения, как фенолы, метилфенолы (крезолы), альдегиды и другие, менее безопасные соединения, содержащие в дыме, воздействуют на пищевые продукты при копчении.

    Антимикробные агенты, более сильнодействующие по сравнению с теми, которые используются для консервирования, находят применение в других областях. К таким ингибиторам относятся соли тяжелых металлов (например, сулема НgСl2), хлорноватистая кислота (НОСl), бром, йод, детергенты (мыло) и органические растворители, а также разнообразные синтетические и природные антибиотики.





    Список литературы:


    1.  Современная микробиология под редакцией Й. Ленгелера, Г. Древса,

    Г. Шлегеля ; Москва, 2005, - 288с.


    2.  Общая микробиология под редакцией Л. В. Алексеевой и Е. Н. Кондратьевой, - Москва 1987, - 566с.


    3. Метаболизм бактерий Гусев М.В. Минсева Л.А. Москва, 1992, - 384с.


    4. Экология бактерий Громов Б.В. Павленко Г.В. Ленинград (Санкт-Петербург). – 328с.


    Страницы: 1, 2, 3


    Приглашения

    09.12.2013 - 16.12.2013

    Международный конкурс хореографического искусства в рамках Международного фестиваля искусств «РОЖДЕСТВЕНСКАЯ АНДОРРА»

    09.12.2013 - 16.12.2013

    Международный конкурс хорового искусства в АНДОРРЕ «РОЖДЕСТВЕНСКАЯ АНДОРРА»




    Copyright © 2012 г.
    При использовании материалов - ссылка на сайт обязательна.