Методы культивирования возбудителя ранней пятнистости и оценки устойчивости растений к заболеванию

Методы культивирования возбудителя ранней пятнистости и оценки устойчивости растений к заболеванию

Введение

Томаты принадлежат к важным овощным культурам, они поражаются многими заболеваниями, которые ведут к снижению урожая, и одним из наиболее опасных заболеваний является ранняя пятнистость (альтернариоз) томатов. Эта болезнь, вызываемая грибами Alternaria solani (Sorauer (1896)) и, Аlternaria alternata f. sp. lycopersici (Grogan, Kimble & Misaghi 1975), является одной из наиболее распространенных заболеваний томатов. Ранняя пятнистость может встречаться в различных почвенно-климатических условиях, но наиболее сильно проявляется в областях с обильной росой, дождями и высокой влажностью. У томатов заболевание вызывает увядание рассады, затем гниль шейки, повреждения листьев, стеблей и гниль плодов. Заражение растений может привести к полной потере урожая. Ранняя пятнистость увеличивает восприимчивость растений к другим инфекциям, путем уменьшения фотосинтетической поверхности листа, увеличения дисбаланса между питательным требованием плодов и поставкой питательных веществ листьями [2].

Поэтому на сегодняшний день борьба с альтернариозом томатов является актуальной.

Для контроля заболевания используют устойчивые сорта, а также обработку растений фунгицидами. В настоящее время используемые фунгициды утрачивают свою активность и вызывают экологические проблемы (загрязнение окружающей среды). Поэтому целесообразнее использовать наиболее современные классы фунгицидов, которые не токсичны и основаны на возможности индукции в растениях системной устойчивости.

На сегодня в научной литературе отсутствуют однозначные данные о возможности индукции системной устойчивости у растений томата к ранней пятнистости, в связи с чем данный вопрос имеет большое практическое и теоретическое значение.

Целью работы было отработка методов культивирования возбудителя ранней пятнистости и оценки устойчивости растений к заболеванию. На данном этапе были поставлены такие задачи:

- изучить научную литературу по данному вопросу;

- выделить возбудителя заболевания в чистую культуру;

- отработать методы оценки устойчивости растений томатов к ранней пятнистости.

гриб токсины инокуляция растение

1. Обзор литературы

1.1 Биологические особенности возбудителей ранней пятнистости Alternaria solani и Alternaria alternata f. sp. lycopersici

A. solani впервые описали в 1896 (Ellis & Martin) Sorauer [9].

Гриб принадлежит к отделу Ascomycota, подотделу Pezizomycotina, классу Dothideomycetes, подклассу Pleosporomycetidae, порядоку Pleosporales, семейству Pleosporaceae [Index]. А. solani принадлежит к многоспоровой группе в пределах рода Alternaria, которая характеризуется отдельными конидиями, иногда по 2 в цепочке. Конидиеносцы до 110 мкм длиной, 6-10 мкм толщиной. Конидии А. solani прямые, слегка изогнутые, обратно-булавовидные, удлиненно-овальные, клювоподобные, суживающиеся в длинный акрогенный отросток одинаковый по длине или, чаще, длиннее тела конидии. Отростков может быть 2-3. Окраска конидий светло-зеленоватая; старея конидии становятся темно-желтыми, бурыми, с 9-11 поперечными и 1-3 продольными перегородками. Тела конидий – 62-235 Ч 13,5-27 мк, по другим данным – 90-140 Ч 12-20 мк, 104-200 Ч 15-25 мк; размеры акрогенного выроста – 40,5-202 Ч 2,5-5 мк. Общая длина конидий – 120-130 мк, иногда до 150-300 мк [2].

А. solani явялется некротрофным патогенном. Она не имеет известной половой стадии или перезимовывающих спор [8].

Цикл развития простой, включающий в себя грибницу и бесполое конидиальное спороношение. Если спора находится в семени, гриб может инфицировать проросток сразу после того, как семя проросло. В других случаях споры переносятся ветром на растение, где начинается инфицирование [18].

При достаточной влажности и температуре (20-25 °С) конидия прорастает и формирует несколько ростовых трубок. Они впоследствии проникают в эпидермальную клетку хозяина непосредственно, используя апперессорию, или они проникают через раны. Проникновение может происходить, при температуре между 10 и 25 °С. Колонизация хозяина облегчена благодаря использованию ферментов, которые разрушают клеточную стенку хозяина и благодаря токсинам, которые убивают клетки хозяина и позволяют патогену получать питательные вещества из мертвых клеток. Повреждения становятся видимыми через 2-3 дня после инфицирования, продукция спор начинается через 3-5 дней [3].

Зимует гриб на послеуборочных остатках вегетативной массы в виде мицелия или конидий, а иногда и в сухих остатках пораженных плодов. Относительно короткий цикл болезни делает возможным полицикличность инфекции [3].

Жизненный цикл А. solani включает как почвенную и семенную стадии, так и стадию переноса по воздуху, поэтому патоген трудно контролировать посредством севооборота и очистки [3].

A. alternata f. sp. lycopersici впервые описали в 1975 г. Grogan, Kimble и Misaghi

Гриб относится к отделу Ascomycota, подотделу Pezizomycotina, классу Dothideomycetes, подклассу Pleosporomycetidae, порядоку Pleosporales, семейству Pleosporaceae [9]. Грибные колонии обычно от черных до серых. Конидиофоры одиночные или в маленьких группах. Они могут быть простыми или разветвленными, прямыми или извилистыми. Цвет от бледного до оливкового или золотисто-коричневого. Они гладкие и могут быть 50µm в длину и 3-6µm в ширину с одной или несколькими конидиальными «шрамами». Конидии длинные, разветвленные, могут быть яйцевидными или эллипсоидными. В случае эллипсоидных, они без носика, обычно они имеют короткий конический или цилиндрический носик. Конидии от бледных до золотисто-коричневых. Они гладкие или нет, с 1-8 поперечными и продольными или наклонными перегородками. Их полная длина 20-63(37)µm и 9-18(13)µm ширина, в самой широкой части. Носик может быть 2-5µm в ширину, и примерно одна треть длины конидии.

Жизненный цикл. Первоначально конидия приземляется на листья, ближайшие к земле и прорастает, формируя одну или более ростовые трубки [19].

Первая линия защиты, которую следует преодолеть грибу – это кутикула, которая состоит из кутина и восков. A. alternata f. sp. lycopersici секретирует эндоглюканазу, синтез которой вызван патоген-индуцированным возрастанием рН на растение хозяине. Эндоглюконазы и экзоглюконазы участвуют в патогенном процессе A .alternata f. sp. lycopersici [18].

Проникновение осуществляется через края листьев, раны, или непосредственно путем формирования апперессория. После проникновения гифа растет межклеточно, и в первую очередь наблюдается разрушение средней ламеллы. Сначала наступает коллапс эпидермальных клеток, затем губчатой паренхимы, и в конце палисадных клеток. Грибы обширно растут на мертвых тканях. Конидиофоры развиваются в концентрических кольцах или зонах через несколько дней после проникновения на обратной стороне листа.

Грибы зимуют на лигнифицированных растительных остатках [19].

1.2 Патологический процесс Alternaria solani и Alternaria alternata f. sp. lycopersici у растений томатов

1.2.1 Симптомы заболеваний, вызванных грибами рода Alternaria

Грибы Alternaria solani и Alternaria alternata f. sp. lycopersici – лиственные патогенны, которые вызывают относительно медленное разрушение тканей хозяина через уменьшение фотосинтетического материала. Род Alternaria обычно поражает воздушные части хозяина. Симптомы начинаются с маленьких, округлых, темных пятен. По мере развития болезни пятна могут увеличиваться до 1 см или более в диаметре и они обычно серые, серовато-коричневые, или ближе к черному цвету. Из-за колебаний внешних условий, патоген растет не равномерно, и пятна развиваются на целевых образцах в виде концентрических колец. В тех случаях, когда листья томатов достаточно велики, что на них наблюдается неограниченное развитие симптомов болезни, пятна, вызванные Alternaria рассматриваются как таковые, которые вызваны другими патогенами, которые вызывают такую же диагностику. Повреждения также часто покрыты тонким, черным, нечетким налетом, это спороношение грибов рода Alternaria на погибающих тканях хозяина [7].

Темные, вдавленные поражения обычно встречаются на корнях, клубнях, стеблях и плодах. Грибы могут спороносить в этих язвах, вызывая тонкий, черный, бархатный рост грибов и спор, чтобы покрыть пораженный участок [7].

Alternaria solani и Alternaria alternata f. sp. lycopersici также продуцируют токсины, которые диффундируют в ткани хозяина. Поэтому наблюдается желтый ареол, который погружается в здоровые ткани хозяина, которые окружают пораженный участок [7].

1.2.2 Биосинтез токсинов грибами рода Alternaria

Фитотоксины – низкомолекулярные компоненты, которые не требуются для нормального развития и воспроизводства. Основываясь на избирательности, фитотоксины могут быть разделены на 2 категории: неспецифические токсины и специфические. В целом, неспецифические токсины оказывают относительно умеренные фитотоксические эффекты, они охватывают широкий спектр разновидностей растений и рассматриваются как дополнительный фактор болезни, например механизм проникновения и ферментативные процессы. Хотя они обычно действуют как вирулентные факторы и усиливают тяжесть симптомов болезни, они не обязательно требуются для возникновения болезни т. к. они также токсичны для растений, не входящих в круг хозяев патогенна.

Для рода Alternaria многие неспецифические токсины были определены, но действие только нескольких из них было изучено в деталях [18].

Специфические токсины участвуют в развитии нескольких заболеваний. Они обычно оказывают серьезные эффекты на достаточно узкий круг хозяев, и являются обязательным фактором для развития заболевания. Токсины, синтезируемые этими патогенами разнообразны по химическому составу, от низкомолекулярных вторичных метаболитов до белков [18].

Хотя место действия токсинов грибов рода Alternaria разнообразно, в конце они все вызывают смерть клеток хозяина [18].

1.2.3 Токсины Alternaria solani

Неспецифические токсины

12 токсинов идентифицировано в культуральных фильтратах A. solani. Среди них альтернариевая кислота и соланопирон А, В и С, альтернариол (AOH) и альтернариол монометиловый эфир (alternariol monomethyl ether (AME)), макроспорин способны вызывать некротические повреждения растений томата [8].

Альтернариевая кислота неспецифический токсин, она вызывает хлороз и некроз листьев томата. Она содержится в покоящихся спорах и продуцируется прорастающими спорами гриба [3].

Было установлено, что альтернариевая кислота изменяет морфологические и физиологические характеристики плазматических мембран возле плазмодесм и таким образом вызывает изменение проницаемости, которое ведет к утечке электролитов. При благоприятных условиях споры прорастают в течение часов и могут образовывать более чем одну ростовую трубку на спору, т. к. споры состоят из нескольких клеток [8].

Альтернариевая кислота не токсична, если она нанесена отдельно на листья томатов, но усиливает инфекционный процесс и развитие некротических симптомов, когда она добавлена в суспензию спор A. solani [3].

Одиночное повреждение на несосудистой ткани листа относительно незначительно. Однако если присутствует одиночное повреждение на сосудистой ткани листа или стебля, где продуцируется альтернариевая кислота, она может быть транспортирована в другие части растения. Отмечено, что повреждения даже маленького сосуда приводит к более интенсивному образованию хлоротичных пятен в окружающих тканях, чем повреждения, которые находятся между сосудами [16].

Существует две поликетидные группы дибезо-б-пироны и антрокуноны. Первая группа включает альтернариол и его монометиловый эфир, альтертенуол, альтенуизол, альтенуен, альтенузин, и дигидроальтенузин [14].

И A. solani и A. alternata продуцируют альтернариол (AOH), альтернариол монометиловый эфир (alternariol monomethyl ether (AME)), макроспорин. AME цитотоксичен, канцерогенен. AME и AOH проявляют синергические эффекты. [13].

Авторы сообщают, что оптимальная продукция A. solani таких токсинов, как альтернариол (AOH), alternariol monomethyl ether (AME) наблюдается при температуре 25°С [13].

Специфические токсины

Также A. solani продуцирует специфические токсины в культуре, оба токсина 1 и 2 «в комбинации» вызывают типичные симптомы раннего увядания на листьях [14].

 Метаболиты могут синтезироваться в диапазоне от 5 до 30°С, однако при критических температурах, они синтезируются в малых количествах [10].

1.2.4 Токсины Alternaria alternata f. sp. lycopersici

Неспецифические токсины

К неспецифическим токсинам Alternaria alternata f. sp. lycopersici относятся альтернариевая кислота, альтернариол, макроспорин, тентоксин и тенуазоновая кислота [14].

Тенуазоновая кислота (TEA) вызывает некротические повреждения с или без образования желтого ореола на листьях. Она подавляет механизм синтеза белка.

Тентоксин (Tentoxin), который действует как фотофосфориляционный ингибитор через специфическое связывание с АТФ-синтазой хлоропласта, вызывая угнетение гидролиза и синтеза АТФ. Из-за того, что этот токсин затрагивает основные клеточные процессы, он является мощным микотоксином [18].

Специфические токсины

К специфическим токсинам, синтезируемым A. alternata f. sp. lycopersici относится AAL-токсины. Первый из них токсин А [TA] был открыт в 1981 году. AAL-токсины – это аминопентольные сложные эфиры, аналоги сфингозина, предшественника сфинганина, сфингониновые аналоги микотоксинов. Они относятся к семейству моноэстеров [18].

Наличие одной пары близких неэстерифицированных диолов в структуре каждого AAL-токсина подтверждает возможное включение эпоксидной гидролазы (EH) в синтез токсинов. Этот гипотетический механизм подтвержден тем фактом, что один из атомов кислорода в диоле присоединяется путем прямого включения атмосферного кислорода, а другой поступает от воды [12].

Гидролазы катализируют гидролиз эпоксидов или ареновых оксидов до их соответствующих диолов путем присоединения воды. Несколько представителей этого подсемейства ферментов представлено в разнообразии в млекопитающих, растениях, насекомых и микороорганизмах [12].

На основании сходства большинство гидролаз относятся к семейству б/ в гидролаз. Это семейство ферментов гидролизует свои субстраты в два этапа, которые включают формирование и гидролиз ковалентной алкил-ферментной промежуточной, которая сформирована при участии нуклеофильной аспарагиновой кислоты [12].

Этот фермент играет определенную роль в способности мицелия инфицировать растения. Активность гидролаз наблюдается одновременно с продукцией пигментов - вторичных метаболитов в стационарной фазе. Также, установили, что синтез AAL токсина происходит одновременно с повышением активности гидролаз [12].

В противоположность токсинам других разновидностей Alternaria alternata, ААL-токсины не вызывают быстрой потери электролитов чувствительных тканей. Подтверждено, что ААL-токсины действуют на аспартат карбамоил трансферазу (ACTаза), ключевой фермент в биосинтезе пиримидина. ACTаза локализована в хлоропластах. ААL-токсины ингибируют развитие клеток на всех уровнях, как у устойчивых, так и у восприимчивых сортов томата [22].

Более того, ААL-токсины ингибируют керамид синтазу в гепатоцитах крысы, и индуцируют апоптоз в клетках почек обезьян [12].

Мутантные формы A. alternata f. sp. lycopersici, не продуцирующие AAL-токсины утрачивают свою патогенность, тем самым подтверждая необходимость этих токсинов для развития инфекционного процесса. AAL-токсины – ингибиторы биосинтеза сфинголипида (керамида). Применение AAL-токсинов ведет к накоплению сфингоидных предшественников, истощению комплекса сфинголипидов и в конце концов к смерти клеток восприимчивых сортов томатов. AAL-токсины, вызывающие смерть клеток растений томатов по механизму действия сходны с генетически контролируемым клеточным суицидом или апоптозом, что подтверждает участие растения в обусловленной токсином смерти клеток [18].

Лестницы ДНК наблюдаются на протяжении смерти клеток в содержащих токсин протопластах и листьях томата. Интенсивность ДНК лестниц увеличивается под действием Са 2+ и угнетается под действием Zn 2+. Интенсивное разделение фрагментированной ДНК на отдельные фрагменты совпадало с появлением лестниц ДНК, что также наблюдается на протяжении смерти протопластов томата. Процесс апоптоза происходит одновременно с процессами развития в растении, и является функциональным процессом, в результате которого формируются симптоматические повреждения на растениях томата [20].

AAL токсины разделяют на 5 групп ТА, ТВ, ТС, TD, TE. ТА и ТВ – наиболее активные изоформы, состоящие из близко связанных компонентов. ТА и ТВ – аминопентолы, средний молекулярный вес 528 Da, они имеют одинаковую специфическую активность.

Токсин ТА индуцирует стререотипические признаки апоптоза, включающее формирование лестниц ДНК, уплотнение ядер ДНК и последующее появление апоптозных телец. Он не угнетает прогресс клеточного цикла [21].

Эта молекула представляет собой новый класс природных токсинов, которые могут быть использованы как модельные компоненты для дальнейшей характеристики молекулярных и бимолекулярных путей, ведущих к апоптозу.

Существует доказательство, что этот микотоксин ведет к разрушению сфинголипидного метаболизма. Важный участок ингибирования – это реакция, катализируемая сфингозин N-ацетилтрансферазой (керамид синтаза).

Cфинголипиды играют важную роль в росте и дифференцировке клеток. Они также могут влиять на пролиферативный потенциал клеток путем индукции или супрессии апоптоза. Полагаясь на факт, что AAL-токсины напоминают сфингоидные основания, сфинголипиды могут вызвать смерть клеток, путем индуцирования апоптоза и/или путем изменения клеточного цикла [21].

Токсичность AAL токсинов изучают на разных тканях томатов, включая листья на разных стадиях развития. Чувствительность наблюдается на всех уровнях, наиболее чувствительны молодые листья [11].

В растениях нечувствительность к AAL-токсинам и устойчивость к AAL-продуцирующей A. alternata f.sp. lycopersici определяется ко-доминирущим Alternaria stem cancer (Asc-1) геном, гомологом гена дрожжей. Хотя, точный способ действия Asc-1 не был определен, базируясь на изучении гомологов у дрожжей, считается, что Asc-1 уменьшает токсин-индуцированное блокирование сфинголипидного синтеза через «спасение» ER-to-Golgi транспорта GPI – заякоренных белков [18].

Аsc locus - ген с двумя аллелями, когда наблюдается полная доминантность – растения устойчивы к патогену, когда неполная доминантность – восприимчивы к токсину [4].

Гомозигота восприимчивых линий в 1000 раз более чувствительна к ААL-токсинам, чем устойчивые линии, в то время как их гибрид F1 имеет промежуточную чувствительность, являясь в 50 раз более чувствительным, чем гомозигота устойчивых образцов [22].

Эти данные подтверждают, если аsc locus контролирует обе функции. К тому же аsc locus удобен для физиологических исследований функционального генного контролирования взаимодействия патоген – хозяин, используя AAL-токсин как молекулярный маркер, если обе реакции контролируются одинаковым локусом. Совместимые или несовместимые взаимоотношения патоген – хозяин часто обусловлены различием только одного гена. Однако различия в физиологическом состоянии устойчивых и восприимчивых инфицированных растений-хозяев часто обусловлено поддельными биохимическими событиями, которые являются следствием аллельного различия между близко связанными, но не относящимися к болезни локусами [4].

Страницы: 1, 2