Перенос генетического материала и генетическое картирование у актиномицетов
Перенос генетического материала и генетическое картирование у актиномицетов
Министерство
сельского хозяйства РФ
ФГОУ ВПО
«Оренбургский государственный
аграрный университет»
Кафедра
микробиологии
Реферат
по генетике
микроорганизмов на тему:
«Перенос
генетического материала и генетическое картирование у актиномицетов»
Выполнил:
студент ΙV курса
ФВМ и Б специальности
«Микробиология» Акжигитов А.С.
Проверил:
преподаватель кафедры
микробиологии Капустина О.А.
Оренбург 2010
Содержание:
ВВЕДЕНИЕ
1.
Перенос
генетического материла у актиномицетов
1.1
Перенос
генетического материала с помощью плазмид
1.2
Передача
генетического материала с помощью рекомбинации
1.3
Перенос
генетического материала посредством трансдукции
2. Генетическое картирование актиномицетов
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
ВВЕДЕНИЕ
Актиномицеты — это группа
микроорганизмов, соединяющая в себе черты бактерий и грибов. Широко
распространены в почвах, в иле водоёмов, в воздухе и на растительных остатках.
Морфологические признаки
актиномицет имеют аналогию со строением несовершенных грибов. Для них характерно
нитевидное или палочковидное и кокковидное строение и наличие боковых выростов;
способны к формированию ветвящегося мицелия на некоторых стадиях развития диаметром
0,4—1,5 мкм, которая проявляется у них в оптимальных для существования
условиях. Подчеркивая бактериальное происхождение актиномицетов, ученые
называют их аналог грибного мицелия тонкими нитями. Актиномицеты включают в
себя организмы с наиболее характерными среди всех бактерий нитчатым строением.
Наиболее важными вопросами, касающиеся
изучения актиномицет, являются исследование механизмов передачи генетического
материала и создание новых способов генетического картирования. На настоящий
момент достаточно подробно изучены способы передачи генетического материала
плазмидами, с помощью рекомбинации, трансдукции, конъюгации гамет, а также
эффективные методы составления генетических карт.
1. Перенос
генетического материала у актиномицетов
1.1 Перенос генетического материала
с помощью плазмид
Это наиболее часто встречающийся
способ переноса генетического материала у актиномицетов.
Линейные плазмиды актиномицетов были
обнаружены раньше, чем линейные хромосомы. Впервые они были описаны у одного из
видов актиномицетов в конце 70-х – начале 80-х гг. Эти плазмиды, pSLA 1 и pSLA
2, были размером несколько более 10 тпн. Они детерминировали синтез антибиотика
ланкацидина. В клетке содержалось до 60 копий таких плазмид. Линейное строение
их ДНК доказывалось следующим образом.
Во-первых, обработка рестриктазами
давала такую комбинацию фрагментов, на основании которой могла быть построена
лишь линейная, но не кольцевая карта. Далее, два фрагмента не входили в гель
при электрофорезе, если ДНК не была депротеинизирована проназой. Если ДНК была
обработана фенолом и додецилсульфатом натрия, то эти фрагменты можно было найти
на электрофореграммах, но их передвижение было аномальным. Лишь после
депротеинизации они передвигались со скоростью, соответствующей их размерам.
Нативная ДНК плазмид была устойчива к 3'-экзонуклеазе, но чувствительна к
экзонуклеазе фага А (5'-экзонуклеаза). Все это свидетельствовало о том, что
плазмиды были линейными, и на их свободных концах находились белки,
прикрепленные к 5'-концам ДНК. Впоследствии было установлено, что на концах
линейных плазмид S. rochei находятся многочисленные повторы длиной в
несколько сот пар оснований. У плазмиды pSCL из клеток S. clavuligerus
концевые участки с повторами, размером около 1 тпн, были очень похожи друг на
друга; правый участок мог гибридизоваться с левым.
ДНК одной линейной плазмиды, pSCL-1
из S. clavuligerus, была полностью секвенирована. Вся плазмида была
размером в 11696 пар нуклеотидов (п.н.). На ее концах были обнаружены
занимающие ~900 п.н. концевые инвертированные повторы, имеющие -70% гомологии с
концевыми участками плазмиды из S. rochei. К концам "крепились"
белки; видимо, с этих участков начиналась репликация ДНК, идущая от концов к
центру линейной плазмиды. Однако в некоторых случаях линейные плазмиды могли
реплицироваться с другой области, расположенной в центре плазмиды. Так,
плазмида pSCL 1 из S. clavuligerus размером в 12 т.п.н. могла быть
клонирована в плазмиде Е. coli pUC 19, Если затем кольцевую химерную плазмиду
выделяли из клеток Е. coli, то она реплицировалась в клетках актиномицетов как
кольцевая молекула. Это свойство сохранялось и тогда, когда рестриктазами
"обрезали" концевые части pSCL 1 и "закольцовывали"
основную часть плазмиды лигазой. Видимо, второй ориджин репликации в нормальных
условиях роста был критическим. Есть упоминание о том, что линейная плазмида
pSA 1 под влиянием определенных мутаций может реплицироваться как кольцевая структура;
при этом ее копийность возрастает от I до 20 - 30 копий на клетку. Линейные
плазмиды могли быть конъюгативными.
Все сказанное выше относилось в
основном к плазмидам актиномицетов в 10 – 15 т.п.н. Однако наряду с ними в
клетках актиномицетов существуют огромные плазмиды с линейной структурой: от 50
тпн (например, SLP 2) до 300 – 590 т.п.н. (SCP 1 и ряд других плазмид; 26 - 28;
76). Одна из этих плазмид – SCP I – была известна гораздо раньше, но лишь
недавно с применением пульсфореза удалось показать ее линейную структуру и
другие особенности строения. В поле пульсфореза она вела себя как линейная
дрожжевая хромосома сходных размеров; другим доказательством ее линейности
служили расчеты с построением рестрикционной карты после применения целого
спектра рестриктаз. Для этой и других гигантских плазмид характерна очень
большая величина концевых участков с инвертированными повторами; у SCP 1 каждый
концевой участок имел размер в 40 тпн, что в сумме составляло заметную часть
всей длины плазмиды. Интересно, что у крупной линейной плазмиды SLP 2 правый
концевой участок был практически полностью гомологичен обоим концам линейной
хромосомы клетки, что вначале вызвало недоумение (три одинаковых концевых
участка в клетке, обладающей лишь одной линейной хромосомой). Однако затем была
выявлена "плазмидная принадлежность" одного из этих концов.
Гигантская плазмида SCP 1 может нести участки хромосомы, и участки этой
плазмиды могут включаться в хромосому. При ее огромной величине ее копийность
равняется приблизительно четырем копиям на клетку, что составляет ~20%
плазмидной ДНК на клеточный геном.
1.2 Перенос
генетического материала с помощью рекомбинации
Явление рекомбинации у актиномицет напоминает
гибридизацию у высших организмов. Установлено, что при контакте клеток (чаще
дефектных) двух разных штаммов бактерий или актиномицетов свойства одного
штамма переходят к другому. В результате получаются смешанные формы с
признаками двух исходных культур. Такой процесс происходит между двумя
родственными организмами.
Явление генетической рекомбинации было продемонстрировано многими
исследователями у ряда представителей рода Streptomyces, в том числе продуцирующих
антибиотики, но только у одного из штаммов Str. coelicolor генетические исследования проводились
планомерно в течение многих лет . Однако, хотя основные сведения о генетической
системе актиномицетов получены для Str. coelicolor, результаты
исследований других видов актиномицетов согласуются с ними, что дает
возможность говорить об общих особенностях генетической рекомбинации в пределах
рода Streptomyces (Actinomyces, по классификации Н. А.
Красильникова).
Методические
подходы при изучении генетики актиномицетов принципиально те же, что и для
других микроорганизмов. Скрещивания производят между штаммами, маркированными
различными генетическими факторами (биохимическая недостаточность, устойчивость
к антибиотикам и др.), а отбор рекомбинантов ведут на специально подобранных
селективных средах. И то и другое необходимо, так как генетическая рекомбинация
— явление редкое и генетические рекомбинанты составляют лишь незначительную
долю в популяции исходных штаммов.
В
настоящее время можно считать установленным, что процесс генетической
рекомбинации у актиномицетов в основном сходен с процессом конъюгации у
бактерий, детально изученным у Е. coli,
Str. coelicolor,
подобно
бактериям, имеет единую кольцевую группу сцепления, на которой определено
местоположение около 40 различных генетических локусов. Характерная особенность
генетической карты Str.
coelicolor
состоит
в неслучайном расположении генетических локусов, сосредоточенных
преимущественно в двух областях карты, тогда как две другие области являются
почти «пустыми». Такое разобщение двух групп локусов в пространстве (возможно,
лишь кажущееся) и послужило причиной первоначального представления о наличии у
актиномицетов двух независимых групп сцепления.
Явление
генетической рекомбинации описано у большинства изученных видов актиномицетов.
Однако возникновение генетических рекомбинантов при внутривидовых скрещиваниях
наблюдается далеко не во всех комбинациях мутантов, даже если они и происходят
из одного и того же штамма. Вопрос о половой полярности штаммов внутри одного
вида до сих пор остается не решенным, хотя и имеются некоторые данные в пользу
ее существования. Лучше изучен вопрос об особенностях самого процесса
генетической рекомбинации у актиномицетов. Этот процесс состоит из нескольких
этапов, причем, как установлено недавними исследованиями, оба родительских
штамма принимают неодинаковое участие в скрещивании: один — играет роль донора,
другой — реципиента генетического материала, напоминая в этом отношении
бактерии.
Как
и у бактерий, в результате переноса генетического материала от одного штамма к
другому происходит образование неполных зигот (мерозигот), содержащих полный геном
реципиентного штамма и часть генома донорного. При этом диплоидный участок
мерозиготы может варьировать как по составу, так и по протяженности, а процесс
возникновения частичного диплоидного ядра происходит во времени. В отличие от
бактерий, для актиномицетов характерно длительное существование стадии
мерозиготы, сохраняющейся в течение ряда поколений, постепенно сменяющейся
стадией образования гаплоидных рекомбинантов. В соответствии с этим у
актиномицетов описаны клоны, являющиеся по своей генетической структуре
мерозиготами. Они характеризуются нестабильностью и в процессе размножения
выщепляют различные клоны гаплоидных рекомбинантов. Открытие таких клонов,
названных гетероклонами, дало возможность разработать простой метод
генетического анализа у актиномицетов, основанный на учете различных типов
гаплоидных рекомбинантов в потомстве гетероклонов.
Таким
образом, процесс генетической рекомбинации у актиномицетов состоит из
нескольких этапов, последний из которых заключается в образовании гаплоидных
рекомбинантов. Эти рекомбинанты, в отличие от гетероклонов, являются
стабильными и служат основным объектом исследований в промышленных
скрещиваниях. Однако необходимо иметь в виду, что вследствие неодинакового
участия двух родительских штаммов в скрещивании, когда один из них поставляет
только часть своего генетического материала другому, гаплоидные рекомбинанты
наследуют большинство генетических факторов от одного родителя и только
некоторые — от другого. Иными словами, по своей генетической структуре гаплоидные
рекомбинанты, как правило, более напоминают одного родителя, чем другого, что
неизбежно ограничивает возможности гибридизации у актиномицетов.
Наряду
с генетической рекомбинацией у актиномицетов наблюдается другое широко распространенное
явление — гетерокариозис, во многом сходное с аналогичным явлением у грибов.
Первоначально
считали, что возникновение гетерокарионов между двумя штаммами представляет
собой первый необходимый этап генетической рекомбинации. Однако в настоящее
время имеются данные, что оба эти явления не связаны между собой причинно и
происходят независимо друг от друга. Поскольку гетерокариотические клоны являются
обычно нестабильными, расщеплясь при размножении на оба исходных родительских
типа, гетерокариозис не может использоваться в качестве способа получения
гибридных форм у актиномицетов.
1.3 Передача
генетического материала посредством трансдукции
Трансдукция
- передача генетического материала от одной бактерии (донора) другой
(реципиенту) с помощью умеренных бактериофагов. Открыта в 1952 Дж. Ледербергом
и Н. Циндером при анализе причин изменения наследств, признаков у некоторых
штаммов бактерии (Salmonella typhimurium) при их совместном выращивании обнаружена
у многих бактерий: сальмонелл, шигелл, бацилл, а также у актиномицетов.
Установлено, что при индукции профага иногда происходит включение в зрелую
фаговую частицу фрагмента бактериальной хромосомы. Фаг, несущий генетический
материал бактерии, называют трансдуцирующим (ТФ). При заражении ТФ
чувствительной бактерии фрагмент хромосомы донора переносится в клетку
реципиента. В зависимости от типа бактериофага от донора к реципиенту
переносится либо строго определённый фрагмент бактериальной хромосомы
(специфическая или ограниченная трансдукция), либо любой фрагмент бактериальной
хромосомы (общая или неспецифическая трансдукция). Фаги, осуществляющие
специфическую трансдукцию, как правило, переносят несколько генов, а
осуществляющие общую трансдукцию— 1—2% генов бактерий. В этом случае в ТФ
собственная ДНК заменена аналогичным по размерам фрагментом бактериальной
хромосомы. Это свойство трансдукции используется в генетическом картировании:
по частоте совместного переноса двух генов судят о расстоянии между ними на
хромосоме.
В
случае устойчивой общей трандукции фрагмент включается в хромосому реципиента
за счёт двойного кроссинговера, и в результате возникают устойчивые
рекомбинанты. При абортивной общей трансдукции фрагмент донора не включается в
хромосому реципиента и не реплицируется, поэтому при делении клеток сохраняется
только в одной линии потомков. При ограниченной трандукции фрагмент донора
включается в хромосому реципиента вместе с несущим его геномом фага, который т.
о. переходит в состояние профага.
2. Генетическое
картирование актиномицетов
Генетика актиномицетов исследована
достаточно хорошо. Для наиболее изученных видов еще с конца 50-х гг.
составлялись на основании конъюгационных скрещиваний подробные генетические
карты с множеством нанесенных на них маркеров. Эти карты были кольцевыми.
Генетическое картирование проводится
с помощью Днк – гибридизации. Данный метод основан на способности ДНК и РНК
специфически соединяться (гибридизироваться) с комплементарными
олигонуклеотидными фрагментами, искусственно синтезированными и меченными
ферментом, флюорохромом или изотопом. Эти фрагменты называются зондами. Для
проведения молекулярной гибридизации молекулу исследуемой ДНК расплетают, одну
нить закрепляют на специальном фильтре, который помещают в раствор, содержащий
меченый зонд. Создаются условия, благоприятные образованию двойных спиралей.
При наличии комплементарности между зондом и исследуемой ДНК они образуют между
собой двойную спираль. После окончания гибридизации и отмывания несвязавшихся
продуктов проводится детекция образовавшегося комплекса при помощи соответствующей
метки.
Данные о наличии перестроек генома
ряда мутантов актиномицетов получены в экспериментах по ДНК - гибридизации, в
которых в качестве зонда использовали 0,85 т.п.н. фрагмент плазмиды pUS8,
несущий ген kmr.
Поскольку ДНК актиномицетов имеет
высокий ГЦ-состав (70-74%) , для получения макрофрагментов хромосомной ДНК
используются эндонуклеазы рестрикции, сайты узнавания которых содержат лишь
АТ-пары. А в результате картирования актиномицетов определяют размеры
хромосомной ДНК исследуемых штаммов как сумму размеров обнаруженных
макрофрагментов ДНК, а также определяют длину молекулы ДНК. Дальнейшие
исследования в этой области позволят сделать новые открытия в этой области.
Заключение
Таким образом, на настоящий момент
у актиномицетов описана передача генетического материала с помощью плазмид,
причем для данной группы микроорганизмов характерны не только кольцевые
плазмиды, но также и линейные. Хорошо изучен процесс трансдукции,
осуществляемый с помощью актинофага, а рекомбинация еще находится на стадии изучения.
На основании конъюгационных
скрещиваний с конца 50-х годов были созданы кольцевые генетические карты
актиномицетов. При создании генетических карт применяются химические и
физические методы, наиболее эффективным является метод ДНК-гибридизации, осуществляемый
с использованием олигонуклеотидных праймеров.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1.
Айала
Ф., Кайгер Дж. Современная генетика / Ф. Айала, Дж. Кайгер.- М.:
Мир, 1987.- 368 с.
2.
Гершковиш
И. Генетика / И. Гершковиш. - М.: Мир, 1970. – 280 с.
3.
Захаров
И.А., Мацелюх Б.П. Генетические карты микроорганизмов / И.А.Захаров, Б. П. Мацелюх.
- М.: Наука, 1986. – 250c.
4.
Прозоров
А.А. Строение генома бактерий: единство или многообразие? // Генетика. – 1995.
– Т. 31. – № 6. – С. 741–752.
5.
Прокофьева-Бельговская
А.А. Строение и развитие актиномицетов / А.А. Прокофьева-Бельговская. – М., 1963.
– 250 с.
6.
Рыбчин
В.Н. Основы генетичесой иженерии./ В.Н.Рыбчин. - С.-П.: Издательство СПбГТУ,1999.-
350с.
7.
Сингер
М., Берг Б. Гены и геномы./ М. Сингер, Б. Берг.- М.: Мир, 1998.- 394с.
|