Получение ферментных препаратов выращенных глубинным способом

Анализ монтажных схем показывает, что они обычно состоят из типовых элементов. Рассмотрим одну из монтажных схем с нижним спуском среды, применяемых в самых различных микробиологических производствах. Ее характерной особенностью является установление термических затворов 3 и 5 для предупреждения проникновения посторонней микрофлоры в аппарат по коммуникациям через неплотности в уплотнениях «седло – клапан» запорной арматуры. В материальные трубопроводы, непосредственно соединенные с внутренней полостью аппарата, постоянно подается пар, а образующаяся пароконденсатная смесь отводится в канализацию или специальное устройство (при наличии открытых трубных окончаний). Как показывает опыт микробиологических производств, такие термические затворы обеспечивают весьма эффективную защиту аппаратов и коммуникаций от инфицирования.

В монтажных схемах должен предусматриваться свободный доступ пара во все точки стерилизуемых внутренних полостей аппаратов, трубопроводов и запорной арматуры, что обеспечивает достижение и поддержание требуемой температуры стерилизации. Однако на практике часто одно и то же монтажное оформление коммуникаций и запорной арматуры различного диаметра не обеспечивает равного стерилизующего эффекта. Например, в запорной арматуре и штуцерах малого диаметра требуемой степени стерильности достичь труднее. Ещё большие трудности возникают при термической стерилизации открытых трубных окончаний (пробник 4, штуцер для введения посевного материала 1 трубопровод для удаления отработавшего технологического воздуха 2). Открытые трубные окончания коммуникаций и узлов монтажных схем не позволяют создать в них давление, необходимое для эффективной стерилизации. Использование резиновых шлангов для подключения бутылей и колб с посевным материалом, пробоотборников и ёмкостей с жидкими добавками ещё больше затрудняет процесс стерилизации.

К открытым трубным окончаниям относятся и так называемые штуцеры для продувки коллекторного трубопровода для стерильной питательной среды, соединяющего установку непрерывной стерилизации питательной среды (или аппарат периодического действия) с ферментаторами. Такая схема коммуникации предусматривает подачу острого пара в линию в течение времени, гарантирующего стерилизуемость коллекторов питательной среды.

В процессе культивирования ведётся постоянный контроль за уровнем пены, накоплением ферментов, состоянием биомассы продуцента, рН среды, потреблением некоторых составляющих среды и т. д. По окончании культивирования культуральная жидкость подаётся либо непосредственно в производство, где она используется (спиртовое, пивоваренное, производство глюкозы и т. д.), либо на отделение жидкой фазы от биомассы и твёрдых нерастворимых частиц среды с целью использования фильтрата культуральной жидкости. В некоторых случаях биомасса продуцента поступает на получение ферментных препаратов различной степени очистки.

Последовательность процесса получения культуры микроорганизма является общей как для поверхностного, так и для глубинного способа культивирования. Она включает стадии приготовления посевного материала, приготовления питательной среды, её стерилизации, охлаждения, засева посевным материалом и выращивания. Однако в зависимости от способа культивирования аппаратурное оформление технологической схемы существенно различается.

Технологические схемы глубинного культивирования аэробных и анаэробных микроорганизмов почти не отличаются одна от другой, за исключением того, что в схемах культивирования анаэробных микроорганизмов исключается стадия подготовки воздуха и используются ферментаторы без аэрирующих и перемешивающих устройств.

Из циклона 1 с помощью трубоконвейера 2 они поступают в бункера 3, а из них по трубоконвейеру 4 – на автоматические весы 5. Если требуется ввести в состав среды соли или какие-то иные компоненты в небольшом количестве, то они поступают в шнек 6, транспортирующий сыпучие материалы в норию 7. Из нории компоненты среды поступают в смеситель 8 для приготовления производственной питательной среды. Сюда же поступают вода и жидкие компоненты через соответствующие дозирующие и мерные устройства.

Для растворения солей и клейстеризации крахмала среду подогревают. Подготовленная подогретая среда с помощью насоса 30 поступает в нагреватель 22 системы непрерывной стерилизации питательной среды и затем подается в спиральный теплообменник 23 для выдерживания при температуре 140 °С. Стерильная питательная среда охлаждается в теплообменнике 24 и направляется в чистый стерильным ферментатор 25, который заполняют на 65 – 75 % в зависимости от степени пенообразования при росте культуры.

Посевной материал получают в посевном отделении. Среду для него готовят в специальной небольшой емкости 9, нагревают, перемешивают и насосом 10 направляют в инокуляторы первой 16 и второй 19 ступеней, где проводятся стерилизация, охлаждение и засев среды. Суспензия исходной культуры пересевается вначале в колбы на качалке, затем подается в инокулятор первой ступени 16, выращивается в нем и полностью передавливается в инокулятор второй ступени 19 со стерильной охлажденной средой. Выращенный посевной материал из инокулятора 19 передается в ферментатор 25. В процессе культивирования проводится пеногашение. Пеногаситель стерилизуют в специальном аппарате периодического действия 12, затем охлаждается и поступает через мерник 14 в ферментатор. В процессе культивирования в инокуляторах и ферментаторе растущая культура аэрируется кондиционированным стерильным воздухом. Сжатый в компрессоре и нагретый от 80 до 220 °С воздух после удаления конденсационной влаги поступает в головной фильтр 11, заполненный стекловатой. Далее очищенный воздух поступает в индивидуальные фильтры тонкой очистки 13, 15, 17, 20, 26 и подается для охлаждения пеногасителя и аэрирования растущей культуры в инокуляторах 16, 19 и ферментаторе 25. Отходящий воздух из инокуляторов и ферментатора перед выбросом в атмосферу очищается в фильтрах 18, 21 и 27. Готовая культуральная жидкость насосом 30 или самотеком при перемешивании поступает в теплообменник 28 для охлаждения перед поступлением в сборник 29. Необходимость охлаждения вызвана тем, что сразу всю культуральную жидкость обработать невозможно, а при длительном хранении в сборнике может произойти инактивация ферментов. Из сборника 29 охлажденная жидкость по мере необходимости подается на фильтровальную установку.

1.3 Получение ферментных препаратов из культур микроорганизмов

Культура микроорганизмов, выращенная поверхностным способом, и культуральная жидкость после глубинного культивирования содержат большое количество балластных веществ. Выделение и очистка ферментов – трудоёмкий и дорогостоящий процесс поэтому, если ферментный препарат можно использовать в виде неочищенной культуры микроорганизмов, его очистку не проводят. В таких отраслях, как спиртовая и кожевенная, целесообразнее использовать именно неочищенную культуру микроорганизма; то же самое можно сказать и об использовании культур микроорганизмов в сельском хозяйстве при приготовлении комбикормов и при непосредственной обработке кормов на фермах.

В большинстве отраслей пищевой промышленности (хлебопекарной, пивоварении, виноделии, сыроделии, крахмало-паточном и сокоэкстрактном производствах), а также в текстильной, меховой, микробиологической промышленности и особенно медицине можно использовать только очищенные препараты ферментов, частично или полностью освобожденные от балластных веществ.

Исходным материалом для получения очищенных ферментных препаратов может служить фильтрат культуральной жидкости, реже – биомасса продуцента или водный экстракт из поверхностной культуры продуцента. Ферментные препараты могут быть получены в виде порошков или жидких концентратов. В процессе выделения происходит повышение доли активного белка в общей массе препарата, т. е. увеличивается его удельная активность.

Например, в таблице 1 показаны стадии очистки от сопутствующих ферментов и балластных веществ культуры Endomycopsis sp. 20-9. Анализ таблицы 1 показывает, что чистота глюкоамилазы в препарате возросла в 37 раз, в препарате отсутствует гликозилтрансфераза, а α-амилазная активность может быть отнесена за счёт действия глюкоамилазы, так как использовался колориметрический метод определения активности α-амилазы.

1.3.1 Принципиальная схема получения ферментных препаратов

Схема очистки фермента от балластных веществ сводится к освобождению его от нерастворимых веществ, сопутствующих растворимых веществ и других ферментов. Процессы получения очищенных препаратов из поверхностных и глубинных культур несколько различны. Из поверхностных культур труднее получить высокоочищенные препараты из-за большого количества балластных веществ. Из глубинных культур получить очищенные препараты несколько легче, но при этом приходится вести выделение из разбавленных растворов, если выделение ферментов проводится из жидкой части культуры. Выделение осложняется, если фермент внутриклеточный, и тогда необходимо разрушать клетки микроорганизмов.

Принципиальную схему выделения и очистки ферментов из глубинных и поверхностных культур микроорганизмов можно представить в виде следующей схемы.

Из схемы ясно, что экстракт из поверхностной культуры или фильтрат культуральной жидкости является исходным материалом для получения препаратов ферментов различной степени очистки. На первом этапе выделения отходом процесса является нерастворимая часть культуры – биошрот, содержащий нерастворимые включения среды и биомассу продуцента.

Далее в зависимости от свойств выделяемого фермента и сопутствующего ему балласта схема очистки и получения ферментного препарата может включать различные приемы и методы, такие, как концентрирование, диализ, осаждение органическими растворителями, солями, гель-фильтрование, афинная хроматография, иммобилизация, сушка термолабильных материалов и т. д. Поэтому рассмотрим этапы получения ферментных препаратов.

1.3.2 Технологическая схема получения очищенных ферментных препаратов

Схемы получения ферментных препаратов зависят от свойств выделяемого фермента и методов очистки, примененных для получения препарата нужной степени чистоты. В качестве примера рассмотрим технологическую схему получения препаратов из поверхностной и глубинной культур в виде жидких концентратов, сухих технических препаратов, получаемых сушкой распылением, и препаратов, осажденных органическими растворителями (рис. 2).

Фильтрат охлажденной культуральной жидкости собирается в основном сборнике и по мере надобности передается в сборник небольшой вместимости перед поступлением в подогреватель вакуум-выпарной установки пленочного типа. Концентрат культуральной жидкости с содержанием сухого вещества 6 – 10 % поступает в сборник концентрата. Для получения сухого технического препарата концентрат направляют в башню распылительной сушилки 8. Сухой препарат через циклон 10, бункер 11 и шнек 12 попадает на стадию стандартизации, фасования и упаковывания.

Для получения более очищенного препарата концентрат из сборника подается на осаждение органическим растворителем. Предварительно концентрат охлаждают в теплообменнике до температуры 2 – 3 °С и подают через дозатор в осадитель. Одновременно в осадитель дозируется охлажденный растворитель. Образовавшийся осадок отделяют на сепараторе 16. Надосадочную жидкость направляют на регенерацию, а осадок – на промывку спиртом и повторное сепарирование. Промытый осадок высушивают в вакууме, измельчают, взвешивают, смешивают с наполнителем и направляют на фасование и упаковывание.

При получении ферментных препаратов из культур микроорганизмов, выращенных поверхностным способом, процесс очистки начинается с экстракции ферментов водой. Нерастворимый осадок высушивают и в виде сухого биошрота утилизируют на корм скоту.

Экстракт с содержанием сухого вещества 7 – 14 % при получении из него сухих препаратов не нуждается в дополнительном концентрировании и поэтому может быть сразу направлен на распылительную сушку с целью получения технического препарата, или же экстракт направляется в охладитель, а затем на осаждение органическими растворителями или солевыми растворами. Из экстракта можно получать стабильный жидкий концентрат с содержанием сухого вещества 50%, для чего экстракт направляют в сборник, затем в подогреватель и на вакуум-выпарную установку. Готовый жидкий концентрат фасуют в специальные емкости и направляют на склад готовой продукции. Из глубинной культуры можно также получать жидкие концентраты, например, методом ультрафильтрации.

Существуют многочисленные схемы получения ферментных препаратов различной степени очистки, вплоть до кристаллических и гомогенных препаратов. Такие схемы, созданные в различных странах мира, в большинстве своём очень сложны и сочетают в себе самые различные комбинации технологических приёмов. Поэтому давать какие-то общие рекомендации крайне трудно, и в каждом конкретном случае необходимо проводить кропотливые исследования на всех стадиях выделения фермента из данной культуры продуцента. Только в результате такой работы можно придти к практическим рекомендациям, которые будут справедливы только для данного фермента, данной культуры микроорганизма и для данной среды.

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5