Принципы биохимических исследований
Неподвижная фаза в А. х. представляет собой специально
получаемый сорбент, построенный обычно по схеме: носитель - соединяющее звено
("ножка") - специфич. лиганд. Носителем служит чаще всего сефарозапроизводное
агарозы, имеющее поперечные сшивки. Присоединение к ней лиганда или "ножки",
содержащих, как правило, аминогруппу, осуществляется после активации сефарозы
бромцианом:
Содержание лиганда колеблется от 0,1 до 10 мкмоль на 1 г
влажного сорбента. Сефароза, однако, малоустойчива к действию ряда хим. в-в и
микроорганизмов.
Более стабильны макропористые неорг. носители (кремнезем,
стекло) и орг. полимеры. Если лиганд присоединяется непосредственно к носителю,
эффективность специфич. взаимод. с ферментом заметно снижается вследствие
пространств. затруднений. "Ножка", как правило, устраняет стерич. препятствия,
отдаляя лиганд от носителя. Как и носитель, она должна быть инертной и не
влиять на процессы в ходе А. х., чего, однако, не всегда удается достигнуть. Напр.,
присоединение "ножки" по приведенной выше р-ции приводит к образованию
катионной группировки изомочевины, и сорбент приобретает св-ва анионита. В
кач-ве "ножки" используют обычно ди - и полиамины,аминокислоты,
пептиды, олигосахариды.
Лигандами могут служить субстраты (напр., крахмал или
гликоген при разделении амилаз), однако их превращ. в ходе А. х.,
катализируемое разделяемым ферментом, постоянно изменяет св-ва сорбента. Поэтому,
как правило, применяют аналоги субстратов, устойчивые к дальнейшему превращ., т.е.
ингибиторы ферментов. Так, для выделения протеиназ используют не расщепляемые
ими пептиды D-аминокислот. Эффективны прир. ингибиторы ферментов, напр. пепстатин
- ингибитор аспартильных протеиназ. Иногда применяют лиганды, связывающие
большие группы родственных ферментов (в частности, киназы и дегидрогеназы). Примеры
таких "группоспецифич." лигандов-антрахиноновые красители, аналоги
никотинамидадениндину-клеотида.
Известны лиганды (напр., производные фенилборной к-ты),
имитирующие при взаимод. с ферментом структуру переходного комплекса с
субстратом. Такие лиганды эффективны при выделении сериновых гидролаз.
Разделение в А. х. обычно проводят на хроматографич. колонках;
иногда разделяемую смесь помещают в сосуд с сорбентом и выдерживают до полного
связывания исследуемого компонента. Затем сорбент (в колонке или сосуде) промывают
буферным р-ром для удаления несвязавшихся в-в, после чего десорбируют
исследуемый компонент.д.есорбция (элюция) последнего обычно достигается
повышением ионной силы, изменением рН буферного р-ра или добавлением в него орг.
р-рителя, что ослабляет взаимод. лиганд - фермент. Более избирательна десорбция
р-ром лиганда.
Помимо ферментов, методом А. х. можно выделять также
токсины, рецепторы, ингибиторы, транспортные белки и др. биологически активные
в-ва. Высокой избирательностью отличается т. наз. иммуносорбция, при к-рой в
кач-ве лиганда используют антитела, обладающие специфичностью к выделяемым
белкам; особенно эффективны моноклональные антитела.
Для разделения белков применяется также ряд др. аналогичных
методов.Т. наз. ковалентная хроматография основана на избират. образовании и
последующем расщеплении ковалентных связей между выделяемым в-вом и носителем,
напр. между белком с SH-группами и ртуть-орг. производными агарозы.
Применяется также лигандообменная хроматография, при к-рой
ферменты связываются через функциональный ион металла с комплексоном,
иммобилизованным на носителе.
Получила распространение гидрофобная хроматография, при
к-рой сорбент (напр., фенилсефароза), содержащий гидрофобные группировки,
вкрапленные в гидрофильную матрицу, взаимодействует с гидрофобными участками,
содержащимися на пов-сти белков. Нередко при этом наблюдаются также
ионообменные взаимод., как, напр., при использовании в качестве сорбента
алкиламиносефароз. Избират. выделение гликопротеинов обеспечивают
иммобилизованные на носителях лектины - белки, специфически взаимодействующие с
концевыми моносахаридными звеньями углеводных цепей.
Иммобилизованные субъединицы ряда белков с четвертичной
структурой м. б. использованы для извлечения этих белков из сложных смесей
вследствие специфич. межсубъединичных контактов. А. х. сформировалась как метод
в кон.60-х гг.20 в.
ГЕЛЬ-ФИЛЬТРАЦИЯ ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МЕТОДА.
Привычное название "гель-фильтрация" для
хроматографического метода фракционирования молекул по их размерам можно
сохранить и в случае хроматографии при высоком давлении, где среди используемых
жестких пористых матриц главную роль играет силикагель. Иногда используют и
такие названия, как "молекулярно-ситовая" ("molecular sieve") или "эксклюзивная"
("exclusion... ") хроматография.
Неподвижная фаза при гель-фильтрации представлена жидкостью,
находящейся внутри пористых, хорошо смачиваемых гранул, заполняющих
хроматографическую колонку. Если на такую колонку подается растворенная в
элюенте смесь молекул различных размеров, то крупные молекулы, неспособные
проникнуть внутрь гранул, будут двигаться вдоль колонки вместе с подвижной
фазой;
для них коэффициент распределения К == 0. В то же
время наиболее мелкие молекулы, размеры которых заведомо меньше диаметра пор в
гранулах, будут равномерно распределяться между подвижной и неподвижной фазами.
Для них будет осуществляться хроматографический процесс с присущим ему
замедлением миграции хроматографической зоны; значение К при этом близко
к единице. Для молекул промежуточной величины благодаря статистическому распределению
размеров пор окажется доступной только часть объема неподвижной фазы. Для них 0
< К < 1, поэтому зона или зоны таких молекул будут мигрировать
вдоль колонки быстрее, чем мелкие молекулы, но медленнее, чем крупные. В
результате произойдет фракционирование исходной смеси молекул на зоны в
зависимости от их размеров. Зоны выходят из колонки в порядке убывания этих
размеров. В простейшем случае, когда в исходной смеси содержатся молекулы
только двух категорий (крупные и мелкие), гель-фильтрация позволяет осуществить
"сортировку" этих молекул ("group separation"). В частности,
таким образом проводят обессоливание растворов биополимеров и очистку
макромолекул от сопутствующих им низкомолекулярных компонентов, например от
"предшественников", участвующих в их биосинтезе. Смесь молекул
нескольких промежуточных размеров в ходе гель-фильтрации разделяется на ряд
дискретных групп, различающихся между собой по степени доступности для них
объема внутри гранул. Соответствующие хроматографические зоны мигрируют с различными
скоростями и выходят из колонки в виде разделившихся "пиков".
ЭЛЕКТРОМИГРАЦИОННЫЕ МЕТОДЫ, методы исследования в р-рах
ионизир. в-в и разделения их сложных смесей; основаны на явлении переноса
заряженных частиц в электрич. поле, приложенном к изучаемому р-ру. Осн. параметр,
характеризующий перенос частиц, - подвижность и, т.е. расстояние l,
нак-рое в-во переместится под действием единицы градиента электрич. потенциала Е
за единицу времени
Процессы, связанные с комплексообразованием, ассоциацией или
пересольватацией ионов, а также с изменением состояния р-рителя, приводят к
изменению заряда либо радиуса ионов, что оказывает влияние на их подвижность; на
этом основано применение Э. м. для исследования р-ций в р-рах.
Неодинаковая подвижность мол. ионов и заряженных частиц разл.
хим. природы позволяет использовать Э. м. также для разделения смесей; в данном
случае эти методы часто наз. электрофорезом.
Методы измерения подвижности заряженных частиц. Подвижность,
или скорость миграции индивидуальных ионов, можно определять:
1) по изменению концентрации ионов исследуемого элемента в
приэлектродном пространстве при электролизе;
2) путем смещения в электрич. поле узких зон изучаемых ионов;
3) с помощью подвижной границы между зонами (фронтальные
методы, изотахофорез).
Исследование реакций в растворах. Информацию о равновесных
процессах в р-ре получают при изучении зависимости скорости миграции ионов
исследуемого элемента от концентрации одного или неск. участвующих в р-ции в-в.
По этой зависимости можно выявлять состав продуктов р-ции и определять
константы равновесия.
В случае р-ций комплексообразования изучаемый металл М может
находиться одновременно в неск. ионных формах связи с лигандом А, между к-рыми
устанавливается подвижное равновесие. В такой системе общее, или суммарное,
перемещение в электрич. поле всех ионов, содержащих М и имеющих индивидуальные
подвижности иi, происходит с нек-рой ср. скоростью ис,
характеризующей суммарный электромиграц. перенос металла в единицу времени:
где i - число лигандов в комплексе; - доля металла,
связанного в i-ую ионную форму; - полная константа устойчивости
ионной формы; [М], [А] и [МАi] - соотв. равновесные
концентрации металла, лиганда и комплекса.
Кривая электромиграции (рис.1), отражающая смещение
подвижного равновесия между разл. ионными формами при изменении равновесной
концентрации лиганда, устанавливает области существования: своб. ионов (I); координационно
ненасыщенных форм (II); координационно насыщенных комплексных ионов (III).
Состав комплексных ионов можно определять неск. приемами: по
эмпи-рич. зависимости между подвижностью ионов и величиной их заряда; из
соотношения общей и равновесной концентраций лиганда, к-рое определяется по
скорости электромиграции введенного в систему вспомогат. металла (по ур-нию 2);
по соотношению между коэф. диффузии и подвижностью при одной и той же
концентрации лиганда. Константы устойчивости ионных форм рассчитывают путем
решения системы из п ур-ний вида (2), где п равно числу ионных
форм.
Рис.1. Зависимость средней скорости миграции металла ис
от концентрации лиганда [А]: I, II, Ш - области осуществления соотв. своб. ионов
металла, координационно ненасыщенных форм и координационно насыщенных
комплексных ионов.
При исследовании хим. взаимодействий в р-ре важно сохранение
постоянства состава фонового электролита, к-рое может нарушаться вследствие
электродных р-ций. Поэтому целесообразно использовать аппаратуру,
предотвращающую проникновение продуктов электролиза в рабочую часть прибора. Если
это условие выполнено, то Э. м. дают достаточно правильные результаты благодаря
тому, что отсутствует необходимость введения в изучаемую систему новых фаз - ионообменных
смол, экстрагентов и т.п., вызывающих побочные равновесные процессы.
Помимо равновесий Э. м. позволяют исследовать кинетику
комплексообразования, используя явление дополнит. квазидиффузионного размывания
под действием электрич. поля первоначально узкой зоны, содержащей разл. ионные
формы с разными знаками заряда. Для достижения этого эффекта необходимо
приложить поле такой напряженности, чтобы скорость электромиграц. переноса
ионов превышала скорость протекания комплексообразования.
Для изучения кинетики р-ций можно использовать также зонную
электромиграцию ионов в неравновесном с ними электролите. В обоих случаях
применение Э. м. целесообразно при анализе процессов, скорость к-рых лежит в
пограничной области между медленными и быстрыми р-циями.
Закономерности электромиграции ионов в расплавах солей
исследованы в значительно меньшей степени, чем в водных р-рах. Обычная среда
при проведении электромиграции в расплавленных солях - безводные расплавы
нитратов и перхлоратов щелочных металлов или эвтектич. смеси, имеющие
сравнительно низкую т-ру плавления.
Для электромиграции в расплавах характерны две осн. проблемы:
сильное взаимод. ионов изучаемых металлов и расплавленной соли; отсутствие
электрически нейтрального р-рителя, для к-рого можно измерить истинную скорость
движения ионов. Поэтому обычно их подвижность определяют относительно прибора,
в к-ром проводят электромиграцию. В этом случае данные о подвижности в
расплавах смещены на неизвестную постоянную величину.
Фокусирующий ионный обмен. Этот метод часто наз. электрофоретич.
фокусировкой или просто электрофокусированием, связан с наложением градиента
концентрации или рН р-ра параллельно электрич. полю. Благодаря этому
разделяемые ионы могут изменять величину и знак заряда по мере перемещения в
поле градиента. При этом в фиксир. точках системы каждый компонент переходит в
изоэлектрич. состояние, в к-ром ср. заряд частиц данного компонента равен нулю.
Упомянутые точки являются местом концентрирования (фокусирования) отдельных
компонентов смеси (рис.5). Положение зон фокусирования определяется градиентом
концентрации комплексообразующего реагента или рН р-ра и константами
устойчивости комплексных ионов разделяемых элементов. При разделении смеси
белков или др. амфотерных соед. положение зон определяется значениями их
изоэлектрич. точек.
Для создания градиента рН электродные камеры заполняются
буферными р-рами с разными значениями рН. Напр., для разделения редкоземельных
элементов цериевой группы в 0,001 М р-ре этилендиаминтетрауксусной к-ты рН
должен изменяться по длине колонки от 1,7 у анода до 2,4 у катода.
В сер.60-х гг.20 в. было предложено создавать градиент рН с
помощью амфолитов - смесей алифатич. полиаминокислот. Под влиянием электрич. поля
амфолиты распределяются в соответствии со своими изоэлекгрич. точками и тем
самым образуют градиент рН. Применение амфолитов позволяет добиться весьма
высокой разрешающей способности метода: в нек-рых случаях удается разделить
белки, изоэлектрич. точки к-рых различаются на 0,02 единицы рН.
Схема, поясняющая метод электрофокусирования: а - образование
градиента концентрации лиганда [А] ; б - распределение ионных форм
мигранта; в - концентрирование
лиганда в узкой зоне; см - концентрация мигранта.
Описанный метод, являясь самостоятельным, в то же время
представляет собой вариант зонного электрофореза. Во всех модификациях
последнего идентификацию и количеств. определение в-в в зонах можно проводить
как непосредственно на носителе, так и после элюирования. В обоих случаях
используют методы радиоактивных индикаторов, фотометрию в прямом и отраженном
свете, люминесцентный анализ.
Фронтальные методы основаны на измерении скорости
перемещения границы раздела р-ров с разной плотностью. Классич. вариант метода
был разработан в 1930 и с тех пор применяется для определения подвижности и
разделения высокомол. в-в, в частности белков. В простейшей модификации метода
в U-образную трубку помещают р-р белков, а над ним буферный электролит, в к-рый
погружены электроды. При наложении электрич. поля индивидуальные белки
перемещаются с разл. скоростями, образуя серию границ. Их положение
регистрируют оптич. методами по изменению коэф. преломления.
Изотахофорез. Осн. частью прибора служит капиллярная трубка
с анодным и катодным резервуарами на концах. При анализе анионов анодное
отделение и капилляр заполняют т. наз. лидирующим электролитом, содержащим
анион с высокой подвижностью. Ср. скорость миграции анионов в этом электролите
должна быть выше подвижности любого аниона в исследуемой смеси. Катодное
отделение заполняют т. наз. замыкающим электролитом, анион к-рого имеет
подвижность меньшую, чем подвижность любого др. аниона в смеси. Анализируемый
образец, в к-ром нужно определить содержание анионов, вносят между
предшествующим и замыкающим электролитами. После подачи напряжения (5-10 кВ) при
силе тока до 100 мкА по мере движения анионов к катоду постепенно образуются
зоны индивидуальных анионов определенной длины, разделенные четкими границами,
ширина к-рых составляет 0,2-0,3 мм при диаметре капилляра 0,1 мм. После этого
все зоны будут перемещаться с одинаковой скоростью (отсюда назв. метода). Соотношение
концентраций анионов в двух соседних зонах с1 и с2
в установившемся режиме будет определяться выражением Кольрауша:
с1/с2 = n1/n2,
(4)
где n1и n2 - числа
переноса.
При анализе катионов лидирующий электролит должен содержать
катионы с высокой подвижностью, замыкающий - с миним. для данной системы
скоростью миграции.
Кол-во в-ва в зоне Q и ее длина l в капилляре
постоянного сечения S связаны простым соотношением:
Q = ClS, (5)
где С - коэф. пропорциональности.
В установившеся режиме градиент потенциала при переходе от
лидирующего к замыкающему электролитам скачкообразно возрастает в соответствии
с подвижностью ионов, составляющих данную зону. Это приводит к температурным
скачкам между зонами, регистрируя к-рые с помощью термопары можно определить
расстояние между зонами и по выражению (5) найти кол-во в-ва в зоне.
На электрофоретически разделенные антигены наносят иммунные
сыворотки, содержащие различные специфические антитела. При встрече
соответствующих антигена и антитела в зоне оптимального их соотношения
наблюдается реакция преципитации невооруженным глазом. Иммунный электрофорез
объединяет преимущества электрофореза и иммунной реакции: высокая разрешающая
способность метода, разделяющая компоненты анализируемой системы на основе
электрофоретической мобильности и высокая специфичность иммунных антисывороток.
Электрофорез с иммунофиксацией (JFE) - это двухступенчатый
процесс, использующий электрофорез протеинов на первом этапе и
иммунопреципитацию на втором. При этом исследованию может быть подвергнута
сыворотка крови, моча, спинномозговая или другая жидкость организма. Электрофорез
с иммунофиксацией - один из современнейших методов в кинической лаборатории для
получения характеристик моноклональных иммуноглобулинов. Моноклональная
гаммопатия характеризуется неконтролируемой пролифирацией одного клона
плазменных клеток за счет других клеток. Эта дисфункция часто приводит к
синтезу большого количества одного иммуноглобулина или его субъединицы со
снижением нормальных уровней иммуноглобулинов. При этом на электрофореграмме
выявляется один резко увеличенный пик в бета-гамма-области.
Перекрестный иммуноэлектрофорез.
Информацию о равновесных процессах в р-ре получают при
изучении зависимости скорости миграции ионов исследуемого элемента от
концентрации одного или неск. участвующих в р-ции в-в. По этой зависимости
можно выявлять состав продуктов р-ции и определять константы равновесия. В
случае р-ций комплексообразования изучаемый металл М может находиться
одновременно в неск. ионных формах связи с лигандом А, между к-рыми
устанавливается подвижное равновесие. В такой системе общее, или суммарное,
перемещение в электрич. поле всех ионов, содержащих М и имеющих индивидуальные
подвижности иi, происходит с нек-рой ср. скоростью ис,
характеризующей суммарный электромиграц. перенос металла в единицу времени:
где i - число лигандов в комплексе;
- доля металла, связанного в i-ую ионную форму;
- полная константа устойчивости ионной формы; [М], [А] и [МАi]
- соотв. равновесные концентрации металла, лиганда и комплекса.
Страницы: 1, 2, 3, 4
|