Векторные системы для молекулярного клонирования в Bacillus subtilis

Векторные системы для молекулярного клонирования в Bacillus subtilis

БЕЛОРУССКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

Биологический факультет

кафедра генетики

ВЕКТОРНЫЕ СИСТЕМЫ ДЛЯ МОЛЕКУЛЯРНОГО

КЛОНИРОВАНИЯ В Bacillus subtilis

Курсовая работа

студента 3 курса КОВАЛЬЧУКА К.В.

Научный руководитель:

канд. биол. наук,

доцент ТИТОК М. А.

Минск 2004г.

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ……………………………………………………………………3                                                                                                       

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ………………………………………………………..4                                                                                     

1.1   Клонирующие векторы…………………………………………………..4                                                                             

1.2   Векторы экспрессии……………………………………………………...6                                                                                  

1.3.  Векторы для клонирования промоторов………………………………10                                                  

1.4   Векторы с регулируемой копийностью………………………………..10                                                 

1.5   Векторы для направленной инактивации генов………………………10                                   

1.6   Векторы для получения гибридных белков…………………………...10                                         

1.7   Геномные векторы……………………………………………………....10                                                                                   

ЗАКЛЮЧЕНИЕ………………………………………………………………..10                                                                                                          

ЛИТЕРАТУРА………………………………………………………………..10                                                                                                 

ВВЕДЕНИЕ

Генетическая инженерия является одним из важнейших направлений биотехнологии, науки об использовании живых организмов и биологических процессов в производстве. По сути, генетическая инженерия (её называют также молекулярным клонированием или технологией рекомбинантных ДНК) представляет собой совокупность экспериментальных процедур, позволяющих осуществлять перенос генетического материала из одного организма в другой. В основе этого переноса, лежит  встраивание нужного фрагмента ДНК (вставки) в другую молекулу ДНК (вектор), которая способна реплицироваться в соответствующей клетке-хозяине.

Исторически сложилось так, что наиболее изученными в генетическом плане являются грамотрицательные бактерии, в частности Escherichia coli. И соответственно большинство векторных систем разработано именно для этого организма. Однако существует целый ряд бактерий обладающих свойствами, которые не присущи E. coli. Как правило, это грамположительные микроорганизмы, и чтобы изучать и использовать на практике их свойства разрабатываются векторные системы, учитывающие специфику данных микроорганизмов. Одним из таких микроорганизмов являются грамположительные бактерии Bacillus subtilis.

По изученности генетического аппарата клетки Bacillus subtilis находятся на втором месте после E .coli. Для них характерен нечасто встречающийся среди бактерий процесс споруляции,  и в этом плане они представляют значительный теоретический и практический интерес. B. subtilis имеют важное практическое значение: они широко используются в различных процессах ферментации при промышленном получении антибиотиков и ферментов и в этом отношении обладают рядом ценных свойств, таких как способность секретировать синтезируемый белковый продукт в культуральную жидкость, способность расти на дешёвых субстратах и обладать продуктивностью на один-два порядка выше, чем у грамотрицательных бактерий-продуцентов.

Поскольку B. subtilis обладают целым рядом описанных выше свойств, для этого организма было разработано множество разнообразных векторных систем. В данной работе расмотрены основные типы векторных систем, с помощью которых можно производить различные генетические манипуляции в клетках B. subtilis.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Первоначально большая часть векторов для B. subtilis создавалась на основе геномов умеренных фагов (таких, как rho11 и phi105) , т.к. они обладали большей стабильностью, чем векторы на основе плазмид, реплицирующихся по типу катящегося кольца (rolling-circle-replication, RCR-плазмиды) (Негрук, 1991). В настоящее время большинство векторов конструируется на основе репликонов тета-плазмид, обладающих высокой структурной и сегрегационной стабильностью. Кроме того, в последнее время разработан ряд так называемых геномных векторов предоставляющих дополнительные возможности по сравнению с плазмидными векторами.

1.1. Клонирующие векторы

В штаммах B. subtilis содержится незначительное число естественных плазмид, причём большинство из них являются криптическими. Однако из других видов рода Bacillus, а также других родов грамположительных бактерий, было выделено множество плазмид, способных к автономной репликации в клетках B. subtilis. Первоначально плазмидные векторы для B. subtilis конструировались на основе мелких (размером меньше 10 kb) плазмид различных грамположительных бактерий, в первую очередь на основе плазмид, выделенных из Staphylococcus aureus (pC194, pE194, pUB110 и др.). Однако векторные молекулы, полученные на основе таких плазмид, проявляли высокую структурную нестабильность, и с их помощью можно было клонировать только короткие сегменты ДНК, а длинные сегменты часто подвергались перестройкам (Michel et al., 1980; Ehrlich et al., 1986).

Нестабильность мелких плазмид в клетках B. subtilis обусловлена механизмом их репликации. Указанные плазмиды реплицируются по типу катящегося кольца (RCR плазмиды), а вследствие разобщённости синтеза лидирующей и отстающей цепей, в процессе репликации образуется одноцепочечная ДНК, которая сильно стимулирует рекомбинацию между гомологичными последовательностями (Ehrlih et al, 1986). Одноцепочечный надрез, образуемый во время инициации репликации, также может быть причиной рекомбинации (Michel, Ehrlich, 1986; Baliester et al., 1989; Gros et al., 1989). Кроме того, вставки ДНК могут вызвать образование высокомолекулярных конкатемеров, увеличивая число копий плазмиды (Gruss, Ehrlich, 1989; Dabert et al., 1992), что может повысить частоту рекомбинации, а также поспособствовать отбору плазмид, утративших вставки.

Существует также другой тип плазмид, реплицирующихся в соответствии с механизмом тета-типа. При репликации по этому механизму не образуется интермедиатов в виде одноцепочечной ДНК, и по этой причине векторы, созданные на основе тета-репликонов гораздо стабильнее и, следовательно, эффективнее векторов на основе RCR плазмид. Первые данные об этом были получены в экспериментах по получению и изучению свойств клонирующих векторов pHV1431, pHV1432, pHV1435 и pHV1436 (Janniere et al., 1990).

Челночный вектор pHV1436 (рис. 1) был создан на основе репликона плазмиды pTB19. На основе репликона pAMb1 были сконструированы три клонирующих вектора: pHV1431, и полученные из него pHV1435 (путём инверсии rep-области pAMb1)  и вектор pHV1432 (путём делеции небольшого фрагмента в последовательности rep-области pAMb1).

Рис. 1. Структура клонирующих векторов. ori pTB52 и ori pAMb1,  репликационные регионы природных плазмид pTB19 и pAMb1 соответственно; pBR322, последовательность pBR322, включающая её репликационный регион; - ген устойчивости к хлорамфениколу.

Данные векторы оказались структурно намного более стабильными, чем векторы на основе сигма-репликонов (Janniere et al., 1990):

(1) при их использовании наблюдается гораздо более низкая частота рекомбинации между повторяющимися последовательностями (снижена в 1000 раз)

(2) с их помощью можно клонировать значительно более длинные сегменты ДНК; средний размер вставки 10 и 1 kb, с диапазоном 3 -17 kb и  0.1 - 1.7 kb для векторов на основе тета и сигма репликонов соответственно

(3) в отличие от RCR плазмид они способны к стабильному поддержанию больших сегментов ДНК

Данные свойства характерны и для других векторов, являющихся производными тета-плазмид. Кроме того, было показано, что в отличие от сигма-плазмид, тета-репликоны, со вставками или без них, не образуют или образуют незначительное число высокомолекулярных конкатемеров (Gruss, Ehrlich, 1988; Dabert et al., 1992a; Dabert et al., 1992b). Это также является одной из причин их структурной стабильности.

Помимо клонирующих векторов для Bacillus subtilis был создан ряд векторов специального назначения: векторы экспрессии,  клонирования промоторов и терминаторов, векторы с регулируемой копийностью и т.д. При этом используются векторы на основе как сигма- так и тета-репликонов.

1.2. Векторы экспрессии

В простейшем случае для экспрессии достаточно клонировать нужный ген вместе с его промотором и сайтом связывания с рибосомой (ribosome binding site, RBS) в природную плазмиду, способную реплицироваться в хозяине, в котором нужно проэкспрессировать данный ген. Так, например, в B. subtilis был проэкспрессировать ген термостабильной арабиназы термофильной бактерии  Bacillus thermodenitrificans. Для этого фрагмент, содержащий данный ген (с предполагаемым промотором и RBS) был клонирован в природную плазмиду pUB110 (Takao et al., 2002).

Иногда удобно экспрессировать ген с не своего промотора, что позволяет вести экспрессию на более высоком уровне, или контролировать её. Так, ген термоактивной пуллуланазы гипертермофильной анаэробной архебактерии Desulfurococcus mucosus (apuA) был успешно экспрессирован в B. subtilis (Duffner et al., 2000). Экспрессия гена шла под контролем промотора PamyM (рис. 2).

Рис. 2. Структура вектора pJA803 для клонирования пуллуланазы. RepB - область репликации pUB110; Cm - ген устойчивости к хлорамфениколу; apuA - ген пуллуланазы; PamyM -  промотор гена мальтогенной a-амилазы из B. stearothermophilus.

В обоих вышеописанных случаях наблюдался относительно невысокий уровень экспрессии, однако, белки секретировались в среду в количестве, позволяющем их выделение в чистом виде и дальнейшее изучение свойств.

В случае, когда необходимо регулировать уровень экспрессии или экспрессировать белок в очень больших количествах, используют более сложные системы экспрессии.

B. subtilis является очень удобным организмом для проведения в нём экспрессии различных продуктов, т.к. эта бактерия обладает целым рядом полезных свойств: непатогенность, наличие механизмов секреции, хорошо изученные генетика и условия необходимые для экспрессии генов, простота  манипуляций с использованием стандартных протоколов. Для повышения уровня продукции гетерологичных белков в клетках B. subtilis используют штаммы, дефектные по протеазам. Кроме того, можно применить более эффективные регуляторные элементы транскрипции и трансляции. Так, например, была создана кассета Veg (Lam et al., 1998) содержащая сильные регуляторные элементы, подходящие для эффективной экспрессии и секреции гетерологичного белка. В состав кассеты вошли: промотор B. subtilis veg I;  lac оператор E. coli; сайт связывания с рибосомой (RBS) B. subtilis; лидерная последовательность стафилококкового белка А (SPA); терминатор транскрипции глюконатового оперона B. subtilis (gnt); полилинкер (multiple cloning site, MCS), содержащий сайты рестрикции Xba I, Sma I; стоп кодоны для всех рамок считывания; фланкирующие EcoR I и Kpn I сайты (рис.3).

Рис. 3. Схематичное изображение регуляторных элементов в кассете Veg.

Длина кассеты  356 п.н. RBS - сайт связывания рибосомы; SPA - стафилококковый белок А; MCS - полилинкер. Подробности в тексте.

Кассета Veg была вставлена в полилинкер челночного вектора pM2 (рис. 4) с образованием pM2Veg – вектора для экспрессии и секреции белка в B. subtilis.

Для проверки эффективности функционирования вектора pM2Veg , в качестве гена-репортёра применили ген эндоглюконазы (ген cenA из Cellulomonas fimi). Была осуществлена вставка данного гена в сайт XbaI вектора pM2Veg. С помощью данной системы была достигнута продукция эндоглюконазы на уровне более чем в четыре раза превышающем самый высокий из уровней продукции достигнутых с помощью других систем экспрессии. Экспрессия и секреция белка оставалась на стабильном уровне, и не оказывала ни каких неблагоприятных эффектов на стабильность вектора и жизнеспособность клеток.

Рис. 4. Схематичное изображение векторов pM2 и pM2Veg.

  ori pMB1 и ori pUB110 - репликационные регионы плазмид pMB1 и pUB110, соответственно; ,, -  гены устойчивости к ампициллину, блеомицину и неомицину, соответственно.

С помощью pM2Veg в B. subtilis также экспрессирован ген hEGF – ген фактора роста эпидермиса человека. Регистрируемый уровень hEGF был вполне сопоставим с уровнем экспрессии данного гена при использовании других систем. Эти данные указывают на то, что вектор pM2Veg может успешно использоваться для экспрессии в B. subtilis разнообразных гетерологичных белков.

Ещё одна эффективная система экспрессии разработана на основе ксилозного оперона (Bhavsar et al., 2001).

Созданная система экспрессии состоит из следующих элементов (рис.5b):

1)      промотор PxylA, под контролем которого идёт экспрессия клонированного гена;

2)       5¢- концевой участок гена xylA(ген изомеразы ксилозы), содержащий оптимизированный CRE (catabolite-responsive element) - цис-действующий элемент,  репрессирующий транскрипцию xyl оперона;

3)       оператор xylO, с которым в отсутствие индуктора (ксилозы) связывается репрессор XylR;

4)       ген xylR, кодирующий репрессор XylR, со своим промотором PxylR.

Система была вставлена в вектор pDG364 (Cutting, Horn, 1990), способный интегрировать с хромосомой B. subtilis в сайте amyE путём двойного кроссинговера. Таким образом, полученный вектор, обозначенный как pSWEET, позволяет осуществлять встраивание ксилозной системы экспрессии в хромосому B. subtilis. Для определения эффективности функционирования данной системы экспрессии к её проксимальному концу был пришит репортёрный ген bgaB – ген термостабильной b-галактозидазы из B. stearothermophilus (полученная плазмида обозначена как pSWEET-bgaB) (рис.5b). bgaB можно вырезать вместе с RBS с помощью PacI  и одной из рестриктаз для полилинкера, и заменить его любым интересующим геном.

Рис. 5. a) Структура плазмиды pSWEET-bgaB. AmyE - сайты через которые идёт рекомбинация и интеграция с хромосомой; Cm и Amp - гены резистентности к хлорамфениколу и ампициллину, соответственно; ori - область репликации в E.coli; PacI, сайт рестрикции; b) ксилозная система экспрессии крупным планом. Показаны: ген ксилозного репрессора xylR; промоторы генов xylR  (PxylR) и xylA (PxylA ) и оператор xylO;  урезанный xylA (первые 58 п.н. + TAA), включающий в себя оптимизированный CRE; сайт связывания рибосомы гена tagD (RBS); ген bgaB, кодирующий термостабильную b-галактозидазу.

Данная система экспрессии (далее система xyl) была сравнена с широко применяемой системой экспрессии spac, основанной на применении лактозных репрессора и оператора E. coli для контроля экспрессии в B.subtilis. Для этого был использован вектор pSPAC-bgaB, созданный путём вставки bgaB в плазмиду pDR67(Weickert, Chambliss, 1990), содержащую spac систему для интеграции в сайт amyE. Для обеих систем экспрессии сайты связывания с рибосомой и окружающие генетические элементы были одинаковые. Опыты показали, что
 1) для системы xyl  характерна значительно более высокая разница между уровнем синтеза продукта при индукции и при репрессии (экспрессия при индукции в 279 раз выше, чем при репрессии; для spac системы – в 16 раз); 2) уровень экспрессии при индукции в 16 раз выше, чем у spac системы; 3) в отсутствие индуктора уровень экспрессии ниже, чем у spac системы;  4) система xyl проявляет чувствительность к большему диапазону концентраций индуктора.  

Была протестирована способность системы xyl обеспечивать ксилоз-зависимую комплементацию. Была проведена попытка комплементировать термочувствительные мутанты (tag-12) по tagD гену, кодирующему фермент, участвующий в синтезе тейхоевых кислот (глицерол-3-фосфат цитидилтрансфераза). Ген tagD дикого типа был клонирован в pSWEET (с образованием pSWEET-tagD) для экспрессии под контролем системы экспрессии xyl. Мутанты с интегрированной в amyE с помощью pSWEET-tagD системой экспрессии и геном tagD под её контролем были способны к росту при непермессивной температуре в присутствии индуктора (ксилозы). Т.е. при росте при непермиссивной температуре происходила ксилоз-зависимая комплементация данного температур зависимого мутанта tag-12.

Страницы: 1, 2, 3