Векторные системы для молекулярного клонирования в Bacillus subtilis

Таким образом было показано, что pSWEET является эффективной системой для точно регулируемой экспрессии клонированных генов в B. subtilis и, в частности новой эффективной системой экспрессии для условной комплементации в B. subtilis.

1.3. Векторы для клонирования промоторов

Наиболее удобные и универсальные системы созданные для изучения активности промоторов in vivo представляют собой плазмиду, несущую ген лишённый промотора,  кодирующий продукты, легко поддающиеся количественному анализу (ген-репортёр). Фрагмент ДНК, чью промоторную активность необходимо проанализировать, можно вставить перед геном репортёром. По выходу продукта гена затем можно определить активность данного промотора. Для грамположительных бактерий сконструировано ряд плазмидных векторов для измерения активности промоторов, где в качестве гена-репортёра выступает ген b-галактозидазы или хлорамфеникол ацетилтрансферазы (без промоторов). Главным недостатком этих векторов является их высокая копийность, что мешает их использованию для точного измерения активности промотора in vivo. кроме того, они часто имеют узкий круг хозяев.

 Создан мобилизуемый малокопийный челночный вектор pTCV-lac (Poyart C., Tieu‑Cuot., 1997) с широким кругом хозяев.

Вектор сконструирован на основе двух репликонов - pACYC184 и pAMb1 (рис.6), что позволяет ему реплицироваться в клетках E. coli и в широком круге грамположительных бактерий (Bacillus, Enterococcus, Listeria, Streptococcus). Точка начала переноса плазмиды RK2 обеспечивает способность к  переносу при конъюгации из клетки-донора E. coli в различные грамположительные бактерии. Роль гена-репортёра выполняет ген b‑галактозидазы (без промотора). Вектор присутствует в клетках в количестве 3-5 копий на хромосому; данная малокопийность  позволяет точно измерять активность промоторов.

Рис. 6. Структура вектора pTCV-lac. oriR pACYC184 и oriR pAMb1 - rep-области плазмид pACYC184 и pAMb1, соответственно; ermB - ген устойчивости к эритромицину; aphA-3 - ген устойчивости к канамицину; lacZ безпромоторный ген, кодирующий b-галактозидазу, с сайтом связывания рибосомы для грамположительных бактерий (spoVG); oriT RK2, точка начала переноса плазмиды RK2.

Cконструированный вектор был использован для сравнения активности четырёх промоторов(Ptac, Ptrc, Pspac, PaphA-3) в двух грамположительных палочках (B. subtilis и Listeria monocytogenes) и двух грамположительных кокках (Enterococcus faecalis и Streptococcus agalactiae). Для этого осуществлялась вставка фрагментов EcoR I-BamH I в линеаризованный путём рестрикции рестриктазами EcoR I и BamH I вектор. Во всех данных хозяевах производные вектора оказались стабильными. Показано, что активность исследуемых промоторов, измеренная путём определения активности b-галактозидазы, сильно варьирует в зависимости от вида хозяина, в котором исследуется активность данного промотора. Эти данные показывают, что вектор pTCV-lac можно успешно использовать для анализа регуляции генов в широком круге грамположительных бактерий.

1.4. Векторы с регулируемой копийностью

Сконструированы векторы для грамположительных бактерий, позволяющие уменьшать количество их копий на клетку (Renault et al., 1996). Эти векторы созданы на основе pILnew - малокопийного вектора, построенного на основе репликона pAMb1, несущего ген резистентности к эритромицину и способного реплицироваться в большинстве грамположительных бактерией. Этот вектор, как и все полученные из него производные, несут репликационный регион pAMb1, содержащий необходимый для репликации ген repE (кодирует белок репликации RepE) и его регулятор copF. Ген copF был инактивирован путём введения вставки в уникальный сайт KpnI. Так как продукт copF оказывает репрессирующее действие на экспрессию repE, его инактивация ведёт к увеличению копий плазмид на клетку примерно в 20 раз. Первоначальное состояние малокопийности может быть восстановлено с помощью удаления вставки путём его вырезания из KpnI и последующей сшивки. Вектор pILnew был использован для создания (1) клонирующих векторов, (2) векторов для изучения регуляции генов путём клонирования их промоторов и сайтов связывания с рибосомой, (3) векторов для экспрессии генов, (4) кассет, содержащих репликон с различными полилинкерами, которые способствуют созданию новых векторов.

Рис. 7. Структура векторов. Обозначения сайтов рестрикции: E (EcoRI); B (BssHII); N (NdeI); K (KpnI); B (BglII). Em и Cm – гены устойчивости к эритромицину и хлорамфениколу, соответственно. repE – ген, кодирующий необходимый для репликации белок RepE; orfD – ген-регулятор транскрипции repE; сopF - ген репрессора (CopF) транскрипции кластера repE‑orfD; PorfD-repE - промотор кластера repE-orfD; Pres - промотор гена резольвазы resb. MCSpBS-часть MCS плазмиды pBluescript; oriC - репликационный регион pBluescript.

Для того чтобы с помощью  pILnew можно было осуществлять клонирование, в него был введён полилинкер в различной ориентации с образованием клонирующих векторов pJIM2278 и pJIM2279.

Сконструирован ряд векторов, позволяющих измерить активность промоторов с помощью бактериального люциферазного гена из Vibrio harvei в качестве гена-репортёра. Данный ген-репортёр обладает рядом полезных свойств: высокая чувствительность, возможность быстрого измерения активности, отсутствие фоновой активности в грамположительных бактериях. Были использованы два варианта генов люциферазы. В первом случае применялся кластер генов luxA и luxB  (luxA/B), во втором - продукт слияния генов (luxAB). Преимущество системы luxA/B над luxAB заключается в её высокой термоустойчивости (luxAB инактивируется при температуре выше 37°C) и в отсутствии токсичности в E. coli, что позволяет создавать конструкции в этом удобном промежуточном хозяине перед их переносом в окончательного хозяина. Однако эти гены могут слабо транслироваться в некоторых грамположительных бактериях, и использование слитых luxAB генов значительно улучшает чувствительность системы в некоторых хозяевах.

Векторы pJIM2366 и pJIM2367 содержат luxA/B гены дистальнее полилинкера и двунаправленный терминатор his оперона  Lactococcus lactis для предотвращения транскрипции с проксимально расположенных промоторов. В данных векторах было успешно протестировано ряд промоторов из L. lactis при низком и высоком числе копий вектора (промоторы оперонов mle, his и ald из L. lactis).

Активность многих генов регулируется на уровне трансляции. Поэтому была создана версия luxAB гена, позволяющая изучать эффективность сайтов связывания с рибосомой (RBS) для инициации трансляции. Для этого на уровне инициаторного кодона гена luxAB был введён сайт NdeI, что позволило осуществлять вставку RBS сразу перед стартовым кодоном этого гена. Транскрипция гена luxAB при этом может инициироваться с промоторов, расположенных проксимальнее. Вектор pJIM1715, содержащий слитый ген luxAB без RBS не проявлял люциферазную активность. В данный вектор была осуществлена вставка различных фрагментов гена aldB L. lactis, RBS (конструкция pJIM1723), RBS и анти-RBS (pJIM1728), а также RBS и промотор данного гена (pJIM1726). Данные, полученные с помощью указанных конструкций, показали, что pJIM1715 можно успешно использовать для изучения трансляционной эффективности RBS.

Часто необходимо, чтобы синтез продукта гена шёл на определённом уровне. Для достижения этого можно использовать регулируемые промоторы различной силы. Изменение дозы гена предоставляет дополнительный уровень контроля экспрессии гена. Чтобы показать, что для этой цели можно использовать производные pILnew, в pJIM2279 была осуществлена вставка lux генов и была измерена люциферазная активность при низком и при высоком числе копий вектора. При этом сначала измерялась активность экспрессии с промоторов расположенных  в pJIM2279 проксимальнее MCS (промотор кластера orfD-repE и промотор гена резольвазы), а затем с промоторов клонированных в pJIM2366 и pJIM2367(см. выше). Данные показали, что наблюдается чёткая корреляция между дозой гена (количество копий вектора на клетку) и уровнем люциферазной активности. Был сконструирован клонирующий вектор pJIM2375, содержащий промотор mleS для конститутивной экспрессии на среднем уровне в L.lactis, RBS и сайт для клонирования NdeI.

На основе pILnew были созданы производные векторов pJIM2278 и pJIM2279, в которых репликон pILnew может быть отделён от маркера резистентности путём  разреза одной рестриктазой в уникальном сайте рестрикции. На основе этого репликона можно затем создавать новые векторы несущие различные маркеры или гены-репортёры.

pJIM2244 и pJIM2245 являются производными pJIM2279, содержащими гены устойчивости к эритромицину и хлорамфениколу соответственно. В этих конструкциях из всего полилинкера pJIM2279 оставлен единственный сайт EcoRI (в pJIM2245 также часть MCS плазмиды pBluescript). pJIM2241 и pJIM 2246 являются EmR и CmR производными pJIM2278 соответственно и содержат большую часть полилинкера pJIM2278 на конце BssHII фрагмента содержащего репликон. Первые две плазмиды созданы для восстановления репликона pILnew без дополнительных сайтов рестрикции. Другие две плазмиды позволяют менять маркер, в то время как гены, клонированные в полилинкере, остаются связанными с репликоном.

1.5. Векторы для направленной инактивации генов

Функции не охарактеризованных генов можно изучить путём их инактивации и последующего наблюдения эффекта инактивации при различных условиях роста клетки. Для проведения инактивации генов в B. subtilis создан набор векторов для осуществления инсерционного мутагенеза в хромосоме бактерии (Vagner et al.,1998). Данные векторы, обозначенные как pMUTIN, построены на основе репликона ColE1 (рис.8), поэтому они не способны реплицироваться в конечном хозяине (B. subtilis), что необходимо для проведения инсерционного мутагенеза. Они содержат ген-репортёр lacZ для измерения активности промотора исследуемого гена. Также в векторах присутствует индуцибельный промотор  Pspac, необходимый для контроля экспрессии генов, находящихся в одном опероне с исследуемым геном и расположенным дистальнее от него. Данный промотор необходим из-за возможного полярного эффекта вставки. Промотор Pspac был модифицирован для лучшего контроля его активности. Он репрессируется репрессором LacI (кодируется геном lacI, присутствующим в векторе) и, следовательно, может быть индуцирован IPTG, инактивирующим LacI.

pMUTIN

терминатор

оператор

MCS

1

t 0

O1

есть

2

t 1  t 2  t 0

O1

нет

3

t 0

oid

есть

4

t 1  t 2  t 0

oid

нет