Выделение чистых культур дрожжевых грибов из шишек хмеля

Раньше дрожжи для хлебопечения получали с пивоварен. В конце ХIХ в. развилась целая отрасль по производству прессованных или сухих пекарских дрожжей. Современное производство пекарских дрожжей имеет ряд существенных особенностей по сравнению с бродильной промышленностью. Основная цель такого производства - получение дрожжей, которые с высокой скоростью вырабатывают в тесте углекислый газ за счет брожения в анаэробных условиях. Однако производить их надо при хорошей аэрации, чтобы добиться большего выхода дрожжевой биомассы (эффект Пастера). Полученные дрожжи должны не только обладать высокой бродильной активностью в тесте, но и хорошо храниться, не теряя своих качеств в замороженном или высушенном состоянии. Пекарские дрожжи выращивают в больших сосудах при интенсивном перемешивании и аэрации. При этом питательная среда, основой которой обычно служит меласса, подается постепенно, или порциями. Если добавить сразу много сахара, то метаболизм дрожжей переключится на бродильный (эффект Кребтри) и выход биомассы уменьшится. По завершении роста дрожжи концентрируют центрифугированием и фильтруют. Образующийся на фильтре осадок можно превращать в брикеты прессованных дрожжей. Сухие дрожжи получают высушиванием массы в специальных распылительных сушилках. (#"#">утилизирующих пентозы. В то же время, транспорт сырья на гидролизные заводы оказывается дорогостоящим, поэтому в большинстве стран существуют только локальные мелкие производства кормовых дрожжей, что экологически и экономически более выгодно.

Первый в мире крупный завод кормовых дрожжей мощностью 70 000 т. в год. был пущен в 1973 г. в СССР. В качестве сырья на нем использовали выделенные из нефти н-алканы и несколько видов дрожжей, способных к быстрому росту на углеводородах: Candida maltosa, Candida guilliermondii, Candida lipolytica. В дальнейшем именно отходы от переработки нефти служили главным сырьем для производства дрожжевого белка, которое быстро росло и к середине 80-х гг. превысило 1 млн. т. в год, причем в СССР кормового белка получали вдвое больше, чем во всех остальных странах мира, вместе взятых. Этому способствовала организация большой научно-исследовательской работы. Были подробно изучены специфические особенности окисления и ассимиляции углеводородов, кинетические параметры роста, разработана технология их культивирования в крупных ферментерах объемом в сотни кубических метров. Однако в последующем масштабы производства дрожжевого белка на углеводородах нефти резко сократились. Это произошло как в результате экономического кризиса 90-х гг., так и из-за целого ряда специфических проблем, с которыми связано это производство. Одна из них - необходимость очистки готового кормового продукта от остатков нефти, имеющих канцерогенные свойства.

Другой пригодный вид сырья для производства микробного белка - метанол. На метаноле как на единственном источнике углерода и энергии способны расти около 25 видов дрожжей, в том числе Pichia polymorpha, Pichia anomala, Yarrowia lipolytica. Однако, более выгодным считается выращивание на метаноле метилотрофных бактерий, таких как Methylophilus methylotrophus, так как они используют одноуглеродные соединения более эффективно. Поэтому при росте на метаноле бактерии дают больше биомассы, чем дрожжи. Первая реакция окисления метанола у дрожжей катализируется оксидазой, а у метилотрофных прокариот - дегидрогеназой. Ведутся генноинженерные работы по переносу гена метанолдегидрогеназы из бактерий в дрожжи. Это позволит объединить технологические преимущества дрожжей с эффективностью роста бактерий.( Шлегель Г).

В последнее время интенсивно изучаются дрожжи, обладающие гидролитическими ферментами и способные расти на полисахаридах без их предварительного гидролиза. Использование таких дрожжей позволит избежать дорогостоящую стадию гидролиза полисахаридсодержащих отходов. Известно более 100 видов дрожжей, которые хорошо растут на крахмале как на единственном источнике углерода. Среди них особенно выделяются два вида, которые образуют как глюкоамилазы, так и α-амилазы, растут на крахмале с высоким экономическим коэффициентом и могут не только ассимилировать, но и сбраживать крахмал: Schwanniomyces occidentalis и Saccharomycopsis fibuliger. Оба вида - перспективные продуценты белка и амилолитических ферментов на крахмалсодержащих отходах. Ведутся поиски и таких дрожжей, которые могли бы расщеплять нативную целлюлозу. Целлюлазы обнаружены у нескольких видов, например у Trichosporon pullulans, однако активность этих ферментов низкая и о промышленном использовании таких дрожжей говорить пока не приходится. Дрожжи из рода Kluyveromyces хорошо растут на инулине - основном запасном веществе в клубнях топинамбура - важной кормовой культуры, которая также может быть использована для получения дрожжевого белка.( Роуз Э).

Еще один субстрат, пригодный для получения кормового белка - молочная сыворотка, побочный продукт сыроварения. Молочная сыворотка содержит до 4% лактозы. Способность к ассимиляции лактозы имеется примерно у 20% всех известных видов дрожжей. Гораздо реже встречаются дрожжи, сбраживающие лактозу. Активный катаболизм лактозы особенно характерен для дрожжей из рода Kluyveromyces. Эти дрожжи можно использовать для получения на молочной сыворотке кормового белка, этанола, препаратов β-глюкозидазы.

Этанол широко применяется в химической промышленности как исходное соединение для синтеза многих веществ, как растворитель, экстрагент, антифриз и т.п. Вероятно, у этанола большое будущее и как топлива в двигателях внутреннего сгорания: этанол - гораздо более экологически чистое топливо, чем бензин.

В принципе этанол можно получать из любого источника углеводов, которые сбраживаются дрожжами. Разнообразие потенциальных продуцентов тоже велико: более 200 видов дрожжей способны сбраживать глюкозу.

Крупномасштабное получение этанола в качестве топлива осуществляется в основном в Бразилии и других странах Южной Америки. В качестве источника углеводов используется сахарный тростник и маниока, в качестве продуцента этанола - Saccharomyces cerevisiae.

Перспективным сырьем для получения спирта являются отходы целлюлозно-бумажной и деревообрабатывающей промышленности. Однако, гидролизаты древесины содержат большое количество пентоз. До середины 70-х годов XX в. вообще не были известны дрожжи, активно сбраживающие пентозы. Сейчас такие виды найдены: Pachysolen tannophilus и Pichia stipitis (анаморфа - Candida shehatae). Им прочат большое будущее в производстве спирта из гидролизатов древесных отходов, соломы, торфа и т.п.

В небольших масштабах этанол можно получать и из других субстратов, например из молочной сыворотки, используя сбраживающие лактозу дрожжи из рода Kluyveromyces.

В последние десятилетия разнообразие биотехнологических процессов, в которых используются дрожжи, резко увеличилось. Еще более разнообразны перспективы использования дрожжей: в различных разработках, патентах и т.п. упоминается более 200 видов. Сейчас дрожжи используются для получения различных ферментных препаратов, органических кислот, полисахаридов, многоатомных спиртов, витаминов и витаминных добавок, а также во множестве других мелкомасштабных процессах.

Промышленно важные органические кислоты, продуцируемые микроорганизмами, являются либо конечными продуктами (молочная, масляная, пропионовая кислоты у анаэробных бактерий), либо интермедиатами метаболизма. Последние можно получать с помощью дрожжей. В наибольших масштабах производится лимонная кислота, в основном с помощью Aspergillus niger, с использованием в качестве субстрата мелассы. Однако, ее можно получать и с помощью дрожжей на более дешевых субстратах, таких как парафины нефти или этанол. Сейчас разработаны технологии получения и многих других кислот, например, изолимонной из Candida catenulata, фумаровой из Candida hydrocarbofumarica, яблочной из Pichia membranaefaciens и др. ( Грачёва. И.М.).

Из дрожжевых полисахаридов наиболее известен пуллулан, который получают из дрожжеподобного гриба Aureobasidium pullulans. Он представляет собой β-глюкан, в котором мальтотриозные остатки соединены между собой β (1>6) гликозидными связями. Пуллулан используется в основном в пищевой промышленности в качестве пленочного покрытия. Возможно получение разнообразных по строению и свойствам полисахаридов и из других видов дрожжей. Особенно много внеклеточных полисахаридов образуют дрожжи Cryptococcus, Rhodotorula, Lipomyces.

Многоатомные спирты (глицерин, ксилит, эритрит, арабит) - широко применяются в химической и пищевой промышленности. Перспективным считается способ получения сахароспиртов, таких как глицерин, эритрит и ксилит, с использованием ксеротолерантных дрожжей рода Zygosaccharomyces. Эти дрожжи способны расти в средах с высоким осмотическим давлением, синтезируя при этом большое количество внутриклеточных полиолов, которые служат осмопротекторами. Другой способ касается получения ксилита - важного полиола для пищевой промышленности. Ксилит накапливается как побочный продукт при сбраживании ксилозы дрожжами Pachysolen tannophilus.

Многие дрожжи служат источниками для получения ферментных препаратов, которые используются в современной пищевой и химической промышленности. Из дрожжевого осадка, образующегося как отход пивоварения, получают фермент β-фруктофуранозидазу (инвертазу), расщепляющий сахарозу на глюкозу и фруктозу. Препараты инвертазы широко применяются в кондитерской промышленности для предотвращения кристаллизации сахарозы, для приготовления инвертных сиропов. С помощью культур Kluyveromyces marxianus получают β-галактозидазу, которая применяется в молочной промышленности. Дрожжи Yarrowia lipolytica используются для получения липолитических ферментов, представляющих большой интерес для многих отраслей хозяйства. Липазы используются в сыроварении, в косметической промышленности, при выделке мехов и кож, в моющих средствах. В последние годы разработано множество способов получения самых различных ферментов из дрожжей: пектиназ из Saccharomycopsis fibuliger, амилаз из Schwanniomyces occidentalis, ксиланаз из Cryptococcus laurentii, гидролаз L-α-амино-ε-капролактама из криптококков, алкогольоксидазы из Pichia burtonii, оксидазы D-аминокислот из Trigonopsis variabilis, фенилаланинаммиаклиазы из Rhodotorula glutinis. Это лишь немногие примеры получения дрожжевых ферментных, спектр которых в последние годы постоянно расширяется.

Применение дрожжей как источников витаминов началось в 1930-е годы. Одним из первых промышленных процессов получения витаминов было выделение эргостерина из Saccharomyces cerevisiae с последующим облучением ультрафиолетом для перевода в витамин D. Затем у дрожжей была открыта способность к сверхсинтезу некоторых витаминов группы В, в частности рибофлавина. Некоторые красные дрожжи используются для получения каротиноидов, в частности β-каротина, служащего предшественником витамина A, астаксантина, используемого в качестве кормовой добавки в рыбоводстве. Кроме производства индивидуальных витаминов уже много лет в мире практикуется получение автолизатов и гидролизатов дрожжей, питьевых дрожжей, которые используются как источник витаминов и как вкусовые добавки ( И.М. Грачёва, Л.А. Иванова. В.М. Кантере).

1.4 Систематика дрожжей

Одноклеточная организация дрожжей накладывает столь существенный отпечаток на их внешний облик и на методы работы с ними, что систематика дрожжей долгое время развивалась вполне независимо от систематики мицелиальных грибов. Одно из важных отличий - широкое использование для классификации и идентификации дрожжей физиологических и биохимических признаков. До середины XX в. все одноклеточные грибы рассматривались в качестве достаточно обособленной таксономической группы аскомицетов. Последней точки зрения придерживался, например, В.И.Кудрявцев, автор отечественного определителя дрожжей, который предлагал объединять все дрожжи в самостоятельный порядок Unicellomycetales. В середине XX в. произошло принципиальное событие в систематике дрожжей, когда японскому микологу Исао Банно удалось индуцировать половой цикл размножения у гетероталличных красных дрожжей Rhodotorula glutinis. Полученные им характеристики жизненного цикла однозначно свидетельствовали о принадлежности этих дрожжей к базидиомицетам. Стало очевидным, что среди дрожжей имеются представители совершенно различных таксономических групп грибов, как аскомицетовых, так и базидиомицетовых. После этого большое внимание в систематике дрожжей стало уделяться поиску признаков, позволяющих разделить аскомицетовые и базидиомицетовые виды, даже без наблюдения полного жизненного цикла (так называемых признаков аффинитета). В систематике дрожжей стали активно использоваться биохимические и цитологические признаки.( Хиггинс И., Бест Д., Джонс Д.М.).

Современный период изучения биологического разнообразия характеризуется интенсивным развитием филогенетической систематики, которая направлена на реконструкцию конкретных путей исторического развития организмов. В микробиологии филогенетическая систематика получила мощный импульс развития лишь в самом конце XX в. в связи со сравнительным изучением консервативных нуклеотидных последовательностей в рРНК. К настоящему времени расшифрованы и помещены в компьютерные банки данных, доступные по сети Интернет, нуклеотидные последовательности рРНК у представителей всех известных видов дрожжей. Это позволяет строить филогенетические деревья, отражающие эволюцию их рибосомальных генов.

Оказалось, что группирование дрожжей на основе сходства нуклеотидных последовательностей рРНК во многих случаях не совпадает с группированием по фенотипическим признакам. Многие традиционные признаки, используемые в классификации дрожжей, такие как характеристики вегетативного размножения, форма аскоспор, способность к сбраживанию и ассимиляции сахаров, стали считаться ненадежными, не пригодными для определения филогенетического родства. Секвенирование рРНК (рДНК) сейчас считается необходимым при описании новых видов дрожжей.( Главачек Ф.).

Один из главных вопросов, который активно дискутировался до последнего времени, положение дрожжей в общей системе грибов. Являются ли они предковыми примитивными формами аско- и базидиомицетов, давшими начало более продвинутым и сложно организованным мицелиальным грибам, или вторично упростившимися, возникшими независимо в разных филогенетических линиях грибов в результате конвергенции? Окончательный ответ на этот вопрос был получен лишь недавно в результате развития молекулярно-филогенетической систематики. Сейчас считается окончательно доказанным полифилетическое происхождение дрожжей, их независимое возникновение среди аскомицетовых и базидиомицетовых грибов. После обнаружения базидиомицетовых дрожжей в зимологии возникло представление о дрожжах, как о чисто морфологической, или экоморфологической группе грибов (жизненной форме), лишенной таксономического содержания. В то же время, дрожжи встречаются лишь в некоторых филогенетических линиях грибов, в которых имеются также близкородственные виды, существующие в основном в мицелиальной форме. Примерами могут служить аскомицеты Endomyces, Blastobotrys, базидиомицеты Tilletiopsis, Trichosporonoides, не образующие почкующихся одиночных клеток. Несмотря на отсутствие одноклеточных ассимилятивных стадий такие виды также включают в определители дрожжей, так как филогенетически они очень близки к «настоящим» одноклеточным дрожжам. Поэтому с точки зрения филогенетической систематики, целиком сводить понятие «дрожжи» только к одноклеточной жизненной форме грибов не представляется целесообразным.

Систематика дрожжей, поиск об их места в общей системе грибов продолжают активно развиваться, и в этой области еще не выработано устоявшихся, стабильных представлений. Тем не менее, со времени первых описаний сахаромицетов зимологами пройден очень большой путь в исследовании разнообразия дрожжевых грибов. Основные этапы этого пути отражены в серии определителей голландской зимологической школы, которые выходили с интервалом в 10-20 лет.( Коновалов С.А.).

Понятие вида - одно из сложнейших в биологии. Разработка концепции вида - особенно трудная задача в применении к микроорганизмам, в частности к грибам, по причине их плеоморфизма, сложности жизненных огрпмпциклов, наличия стабильных несовершенных форм, неопределенности границ индивидуума и популяции.

В биологии термин «вид» используется в разных значениях. С одной стороны, о виде говорят как о наименьшей единице классификации, минимальном элементе разнообразия, который мы в состоянии распознать с помощью определенного набора таксономических признаков. Стандартный набор таких признаков, используемых в таксономии дрожжей, постоянно увеличивается, что позволяет выделять все более «мелкие» виды. В результате число известных видов дрожжей за последние десятилетия существенно возросло не только за счет обнаружения новых форм в природе, но и дробления уже известных «крупных», «гетерогенных» видов, характеризующихся значительной изменчивостью. Границы между видами при этом проводятся либо исходя из опыта и интуиции систематика (типологическая концепция вида), либо на основании явного соглашения между систематиками об уровне отличий, достаточном для выделения самостоятельного вида (номиналистическая концепция). В последнем случае вид - это не более чем абстракция, и границы вида устанавливаются исходя из чисто утилитарных представлений об определенном уровне общего сходства между штаммами дрожжей.( Коновалов С.А.).

Наряду с этим в биологии существует и принципиально иное представление о виде, как о целостной, устойчивой и достаточно гетерогенной системе. При этом основное внимание уделяется не столько уровню различий между особями, сколько степени дискретности, отсутствию переходных форм между видами. Такая дискретность наиболее выражена у животных и растений, то есть организмов, размножающихся преимущественно половым путем. Обмен генами при половом размножении как раз и представляет собой механизм, поддерживающий целостность вида, а прекращение такого обмена приводит к возникновению дискретности разнообразия. Поэтому для животных и растений применима биологическая концепция вида: вид - это система популяций, генетически изолированных от популяций других видов и характеризующихся интерфертильностью, то есть способностью особей скрещиваться с образованием плодовитого потомства.

Организмы разных видов не могут скрещиваться, или скрещиваются, но не дают плодовитого потомства. Такая концепция вида применима и ко многим грибам, у которых имеется половой процесс. Изучение интерфертильности играет существенную роль в определении границ видов и у совершенных дрожжей с хорошо выраженной половой стадией в жизненном цикле.

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9