Выделение чистых культур дрожжевых грибов из шишек хмеля

нагревают до растворения агара, затем добавляют 4% глюкозы (или мальтозы), фильтруют, разливают в пробирки и стерилизуют при 0,5 атм 20 мин. После стерилизации среду в пробирках скашивают. Выращивание длится 48 ч при 22°С. Среду можно готовить и не на дрожжах, а из-обычной 1% пептонной воде.

Жидкая среда Сабуро отличается от описанной выше тем, что не содержит агар-агара. Среду разливают в колбы по 150—200 мл, стерилизуют так же, как описано выше. Эта среда употребляется главным образом для получения гомокультуры.

Пивное сусло-агар. Неохмеленное пивное сусло — хорошая среда для некоторых молочнокислых и уксуснокислых бактерий, дрожжей, плесневых грибов и других представителей гетеротрофных микроорганизмов, использующих сахара в качестве источника углерода и энергетического материала. В сусле содержатся аминокислоты, элементы нуклеиновых кислот, витамины (в основном группы В), безазотистые органические кислоты, минеральные соли, большое количество углеводов (до 20%, из которых 80% составляет мальтоза), т. е. все, что необходимо для развития наиболее требовательных сапрофитных микроорганизмов.

Сусло готовят следующим образом. 250 г размолотого солода заливают 1 л водопроводной воды, нагревают до 48—50° и поддерживают эту температуру в течение получаса, непрерывно помешивая смесь, чтобы избежать образования комков. В последующие полчаса температуру поднимают до 55— 58°С и поддерживают ее на этом уровне до полного осахаривания крахмала, т.е: до тех пор, пока реакция остывшей смеси с йодом будет отрицательной. При указанном режиме происходит также гидролиз белков до аминокислот и полипептидов. Экстракт отфильтровывают через вату или бумажный фильтр. В фильтрате определяют концентрацию Сахаров, пользуясь ареометром Баллинга, градусы (°Б) которого примерно соответствуют процентному содержанию сахара в растворе.

Неохмеленное пивное сусло разводят водопроводной водой до содержания сахара 7—8° по Баллингу (измеряют сахарометром) и стерилизуют в бутылях при 110°С 10 мин. В таком виде сусло может сохраняться длительное время. Перед употреблением над осадочную жидкость осторожно сливают с осадка. В 1 л стерильного сусла добавляют 18 г агар-агара, нагревают до растворения агара и разливают среду в стерильные пробирки, стерилизуют при 110°С 10 мин. Жидкое сусло после сливания отстоявшейся жидкости с осадка разливают в пробирки или колбы и стерилизуют при режиме, указанном для сусло-агара.

Рисовая среда Левиной. 20 г риса в зернах измельчают в ступке и заливают 500 мл дистиллированной воды, стерилизуют текучим паром 45 мин. Укрывают тепло и оставляет для отстаивания, затем фильтруют через 4 слоя марли. Осадок не отжимают. 20 г агар-агара расплавляют на открытом огне или текучим паром в 500 мл дистиллированной воды, фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Фильтрат агара смешивают с фильтратом риса и добавляют дистиллированной воды до 1 л. Стерилизуют при 1 атм (120°С) 20 30 мин. Разливают в чашки Петри, на которые производят прямой посев материала. Чашки с посевом, плотно завертывают в 2 слоя бумаги и помещают при комнатной температуре или при 30°С на 18 ч. Результаты посева рассматривают под малым увеличением микроскопа непосредственно на чашке. Отмечают филаментацию, тип микроколоний (паукообразный, звездчатый, круглый и др.).

Стерилизация питательных сред.

Стерилизация является заключительной операцией при приготовлении любой питательной среды. Питательные среды после разливки их в сосуды чаще стерилизуют нагреванием — термостерилизацией. Перед стерилизацией сосуды (колбы, пробирки) с налитыми в них средами закрывают ватными пробкам предохраняющими их в дальнейшем от заражения микробами из вне.

Стерилизация насыщенным паром под давлением. Такую стерилизацию проводят в автоклаве. Автоклав представляет собой двухстенный металлически котел, герметично закрывающийся крышкой. Между стенками котла находится вода. Стерилизуемые объекты ставят на дно автоклава. Автоклав снабжен манометром указывающим давление пара в котле, выпускным краном для выхода воздуха и пара и предохранительным клапаном, обеспечивающим выход пара при превышении заданного давления.

Автоклав обогревается газом или электричеством. Образующийся при кипении воды пар поступает в котел через отверстия, имеющиеся в верхней части его внутренней стенки, и через выпускной края выходит, вытесняя из автоклава воздух. После полного вытеснения воздуха (при этом выделяется сильная сплошная струя пара) выпускной кран закрывают и в автоклаве постепенно повышается давление. Когда оно достигнет 1 атм (по манометру), подогрев регулируют, чтобы поддерживать давление на одном уровне в течение необходимого времени. При таком давлении водяной пар имеет температуру 120° С.

При этой температуре выдерживают питательные среды (если объем их не более 0,5—1 л) в течение 20—30 мин. При таком режиме стерилизации погибают не только вегетативные клетки микроорганизмов, споры плесеней и дрожжей, но и бактериальные споры. По окончании стерилизации выключают источник нагрева, после того как стрелка манометра снизится до нуля, осторожно открывают выпускной кран, чтобы вытеснить из автоклава пар. Крышку автоклава открывают лишь после того, как он охладится.

Стерилизуют в автоклаве воду, мясо-пептонный бульон, дрожжевой автолизат, агаровые и другие среды, которые не претерпевают заметных изменений при темпетуре 120° С.

Стерилизация текучим паром. Эта стерилизация бывает дробной, или последовательной. Она применяется чаще для питательных сред, которые могут заметно изменять свои свойства при стерилизации в автоклаве, например молоко, среды, содержащие сахара, желатин.

Для стерилизации используется аппарат Коха (кипятильник Коха). Он представляет собой металлический цилиндр, покрытый изоляционным материалом, с двойным дном и неплотно закрывающейся крышкой, снабженной термометром. На дно цилиндра наливается вода. Над водой располагается металлическая подставка с отверстиями для прохождения пара, на которую помещают стерилизуемые питательные среды.

Вода в аппарате нагревается газом или электричеством до 100°С. Образующийся пар (текучий), прогревает стерилизуемые материалы, выходит через специальное отверстие и неплотности крышки.

Стерилизация производится дробно — в три приема три дня подряд по 30 мин ежедневно. Повторная стерилизация, вызывается тем, что при температуре 100° гибнут не все споры бактерий. В промежутках между нагревами (каждый — раз в сутки) питательная среда выдерживается в термостате при 25° С. За это время оставшиеся живыми споры прорастают в вегетативные клетки, которые и уничтожаются последующим нагревом при 100° С.

Холодная стерилизация (фильтрация). Метод холодной стерилизации применяется для жидких сред, которые не выдерживают нагревания.

Способ заключается в фильтровании сред через специальные мелкопористые бактериологические фильтры, задерживающие микроорганизмы (ультромикробы проходят).

Фильтры изготовляются из различных материалов из фарфоровой глины, асбеста, нитроклетчатки (мембранные ультрафильтры) и др.

2.3 Выделение дрожжей

Смыв производили непосредственно с шишек хмеля, помещая его в сосуд с водой, встряхивая в колбе с водой 10 мин в качалке, а затем делают высев, образец серийно разводят, чтобы сделать высев сразу на чашке Петри. В качестве суспензионных жидкостей использовали стерильную водопроводную воду, в которую добавляют NаCI (5г на 100мл). Посев «истощающим штрихом» производят петлей: либо, нанося очень густые штрихи, либо прожигая петлю после каждого штриха. (См. рис.). Разные способы посева «истощающим штрихом» для получения отдельных колоний 1, 2, 3, 4, 5, 6 – последовательность нанесения штрихов. На двух последних чашках петлю после каждого штриха прожигают.

Высев производили на плотные питательные среды, внося в каждую чашку по 0,5мл смыва с шишек хмеля. После посева чашки Петри помещали в термостат в течении 24 ч в обычном положении, чтобы агар адсорбировал жидкость, а затем чашки переворачивали, во избежание попадания на поверхность капель конденсата с крышки. Инкубированние проводили при t 37 °С – 48 часов.

Дрожжевые колонии в посевах учитывали следующим образом. Обратную сторону каждой чашки разделяли на 4 части и просматривали все колонии на каждой площади с объективом 10Х количественный учёт численности дрожжей и в единице массы или объёма вычисляли по формуле:

n=абв

а – среднее число колоний в одной чашки Петри;

б – число капель в 1 мл суспензии;

в – степень разбавления образца.

Отдельные изоляты (штаммы) получали путем пересева из индивидуальных колоний в пробирки на те же питательные среды, на которые производили первичный высев.

Перед определением каждую культуру проверяли на чистоту путём микроскопирования и рассева на плотные питательные среды. Из каждой исходной культуры готовили пересевом в пробирку с сусло–агаром контрольную культуру и сохраняли её весь период, по определению не открывая её. Форму описывали и определяли в культурах разного возраста на плотных и жидких средах. Первый просмотр 2–3 сутки культивирования при 25–28 °С, затем культуру оставили при комнатной температуре и описывали. Клетки измеряли микрометром длину и ширину не менее чем у 20 клеток и указывали крайние значения. Измерение производили для культур выращенных на жидких средах. Второй просмотр 1–2 недели при 17–18 °С.

Культуральные свойства полученных колоний Таблица 1

Вегетативное размножение наблюдали на твёрдых средах в культурах 2–3 суточного возраста.

Культуральные признаки микроорганизмов, при росте на плотных средах описывали по штриху.

Отмечали: цвет, консистенцию, структуру поверхности, форму края или границы роста. Для получения стандартного штриха использовали питательную среду сусло-агар с концентрацией СВ 10%

Рост описывали через 6–8 суток при культивировании при 25 °С, первое описание через 6 недель второе описание.

Рост дрожжей в жидких средах наблюдали при использовании солодового сусла Пивное сусло-агар концентрации СВ 12 % или глюкозо–пептонной среды с дрожжевым экстрактом. Посев производили в пробирки на скошенную питательную среду, и инкубировали 7 дней, при комнатной t (17–18 °C).

В ходе проведённых опытов, приведённых в таблице было выделено 14 штаммов бактерий из которых 5 штаммов дрожжей , и 2 штамма кокков , из которых для дальнейших исследований были использованы штаммы дрожжевых микроорганизмов № 2 которые максимально соответствует нашим требованиям.

Пересевы производили в стерильную плотную питательную среду до получения однородных колоний. После каждого пересева содержимое чашек Петри проверяли на чистоту.

2.4 Определение видовой принадлежности

Чистой культурой считается выращенная масса клеток, состоящая из дрожжей, которые принадлежат одному виду и получены как потомство одной клетки.

Дрожжи в виде чистых культур широко используются в технологии производства многих пищевых продуктов (кисломолочные, сыры, хлеб, вино, пиво и др.). Применение культур дрожжей с известными свойствами дает возможность эффективнее использовать их деятельность — экономичнее перерабатывать сырье, получать высокий выход и надлежащее качество продукции.

Идентификация — определение систематического положения микроорганизмов, выделенных в чистые культуры. Для установления семейства, рода, вида, к которому принадлежат выделенные в чистые культуры дрожжей, необходимо изучить их морфологические, культуральные и физиологические признаки.

Морфологические признаки изучаются под микроскопом в препаратах живых и мертвых микроорганизмов.

Культуральные признаки устанавливаются по характеру роста культуры изучаемого микроорганизма на плотных и жидких питательных средах.

Физиологические признаки, обусловленные наличием ферментов в клетках, устанавливаются при посеве в специальные среды, в состав которых входят те вещества, воздействие на которые выявляется у изучаемого микроба.

Каждый новый штамм микроорганизмов должен быть охарактеризован для получения полных данных о свойствах чистой культуры данного микроорганизма.

Результатом идентификации обычно является отождествление выделенного микроорганизма с каким-нибудь видом или отнесение его к определённому роду.

Полученные данные используют для составления паспорта промышленных штаммов, а так же для их идентификации.

Проведя исследования важнейших морфологических, физиологических и культуральных признаков, устанавливают видовое название микроорганизма по определителю («ключу»). Для каждой группы микроорганизмов (бактерии, дрожжи, грибы) существуют свои определители, составленные с учетом специфических особенностей данной группы.

При описании колоний, выросших на поверхности среды отмечают:

- форму, профиль и цвет- невооружённым глазом;

- край- при малом увеличении микроскопа (объектив 8*);

- консистенцию - прикосновение петли к колонии;

- величину – линейкой ( колонии точечные – менее 1мм в диаметре, мелкие – 1-2 мм, крупные – 3-4 мм и более).

Морфологические свойства изучаемых штаммов микроорганизмов. n=5

Таблица 2.

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9