Выделение чистых культур дрожжевых грибов из шишек хмеля

Осмофильные дрожжи, обитающие в природе в гнездах диких пчел (в меде), обнаруживаемые в производстве сахара и при порче меда или других продуктов с большим содержанием сахара, выделяют на средах с высоким осмотическим давлением: на медовом и осмофильном агарах.

Состав сред: медовый агар: 70% меда в водопроводной воде и 2% агара; синтетический «медовый» агар: 60 г глюкозы, 0,5 г дрожжевого экстракта, 2,5 г агара, 100мл воды; осмофильный агар: б сироп, содержащий 35 массовых частей сахарозы и 10 частей глюкозы, добавляют агар и стерилизуют 20 мин при 112°. Повторное расплавление не рекомендуется.

При выделении осмофильных дрожжей посевы делают на указанные среды и для сравнения – на обычные. Сахар, мед или сиропы растворяют в воде и фильтруют через мембранные фильтры, которые затем помещают для проращивания на агаровые среды. (Жвирблянская А.Ю., Исаева В.С). Почвенные олигонитрофильные дрожжи Lipomyces выделяют на безазотистых средах. Примером такой среды может служить модифицированный агар Эшби (в г 1л дистиллированной воды) : Сахароза − 20,0; K2HPO4 − 0,2; KH2PO4 − 0,1 ; MgSO4·7H2O − 0,2 ; NaCl − 0,2; K2SO4 − 0,1 ; Агар − 20,0.

Для подавления роста бактерий к этой среде добавляют 80 мг/л стрептомицина. Посев производят комочками почвы: навеску в 100 мг распределяют на две чашки Петри, по 50 комочков на каждую. Для равномерного распределения используют трафарет, который подкладывают под чашку. Учет обрастаний производят через 25-30 сут. инкубирования при комнатной температуре. Результат выражают в процентах обрастания комочков почвы молочно-белыми слизистыми колониями липомицетов. (Коновалов С.А.).

Дрожжевые колонии в посевах учитывают следующим образом. Обратную сторону каждой чашки разделяют чернилами на большее или меньшее число частей – от четырех до шестнадцати в зависимости от густоты посева – и просматривают все колонии на каждой площади с объективом 10× в просвечивающем микроскопе или с бинокулярной лупой в отраженном свете. Описывают все встречающиеся типы колоний в стандартных терминах. Из них готовят препараты и микроскопируют при больших увеличениях. Этот детальный просмотр колоний при первом посеве очень важен, так как при последующих пересевах некоторые признаки, например спорообразование, иногда исчезают. Рекомендуется сразу же делать фотографии или зарисовки. Колонии разных типов нумеруют и просчитывают отдельно.( Фениксова Р.В.).

Учет производят дважды. В первый срок отмечают с обратной стороны чашки все выросшие и просчитанные колонии, а за тем оставляют чашки еще на несколько дней для наблюдения за возможным появлением колоний медленно растущих дрожжей.

Отдельные изоляты (штаммы) получают путем пересева из индивидуальных колоний в пробирки на те же среды, на которые производили первичный посев, но без добавления специфических ингибиторов.( Бабьева И.П., Голубев В. И.).

Чистой микробной культурой называют популяцию, представляющую собой потомство одного вида микроорганизма. Каждый новый изолят носит название штамма, которому присваивают буквенное или номерное обозначение.

Расами называют производственные штаммы одного вида дрожжей, различающихся между собой по степени проявления физиологической активности.

В генетических исследованиях пользуются так называемыми клонами – чистыми культурами, полученными от одной споры или гаплоидной клетки. (Бабьева И.П., Голубев В. И.).

Существуют прямые и непрямые методы получения чистых культур дрожжей. Первые основаны на выделении одной клетки или споры под непосредственным контролем через микроскоп. Во втором случае используют косвенные приемы для разделения клеток.

Капельный способ Линдера. Суспензию дрожжей разбавляют жидким суслом до концентрации ≈ 100 клеток в 1 мл и стерильным чертежным пером наносят мельчайшие капельки на необезжиренное покровное стекло, простерилизованное фламбированием в пламени газовой горелки. Капельки располагают в определенном порядке, обычно по пять капель в два ряда, т. е. всего 10 капель на стекле. Затем быстро опрокидывают стекло над влажной камерой, которую запечатывают минеральной смазкой. Все капли немедленно просматривают под микроскопом и отмечают те из них, которые содержат по одной единственной клетке. Если все капли содержат по нескольку клеток, то увеличивают разбавление суспензии и процедуру повторяют. После трех – четырехдневного инкубирования, когда отмеченные единичные клетки образуют микроколонии, последние переносят стерильной иглой или полоской стерильной фильтровальной бумаги в жидкую среду и размножают.( Бабьева И.П., Голубев В. И.).

Метод Линдера в видоизменении Надсона. Чистое покровное стекло проводят трижды через пламя горелки и края его обводят мастикой (смесь равных частей парафина и вазелинового масла). На центральную часть стекла наносят полоску прозрачной среды ч 10% желатины или 0,5 агара. В теплую и еще не застывшую среду вносят иглой суспензию дрожжей такого разведения, чтобы в каплю попало всего несколько клеток. Стекло помещают во влажную камеру и рассматривают препарат при малом увеличении микроскопа. (Булгаков Н.И.).

Находят ориентиры, которыми могут быть частички взвеси, пузырьки воздуха или дефекты стекла, и вычерчивают карту с расположенными по отношению к ориентирам одиночными клетками дрожжей. Через каждые 10-20 ч препарат повторно исследуют, зарисовывая все изменения. Когда отмеченные клетки разрастаются в микроколонии, покровное стекло перевертывают на предметное и под контролем глаза при малом увеличении микроскопа переносят иглой материал в пробирки. ( Булгаков Н.И.).

Метод Линдера, упрощенный Вучковичем. Видоизменение Вучковичем метода Линдера сводится к тому, что капельки суспензии, содержащие 3-4 клетки дрожжей, снимают петлей, которой предварительно захватывают стерильную среду, и переносят штрихом на поверхность плотной среды. Через некоторое время появляются микроколонии, число которых на одном штрихе должно соответствовать количеству исходных клеток в отмеченной капельке.

Из этих колоний пересевом выделяют чистые культуры. Таким способом можно сразу получить несколько одноклеточных культур за короткое время.

Выделение спор дрожжей при помощи микроманипулятора. К использованию микроманипулятора прибегают главным образом при необходимости изолировать споры из асков, так как вегетативные клетки легко повреждаются при микроманипулировании.

Аски разрывают либо механически прикосновением игл микроманипулятора, либо заранее обрабатывая суспензию препаратом ферментов (например, из пищеварительного тракта виноградной улитки Helix pomatia), из лизирующих клеточную стенку дрожжей.

Для работы с микроманипулятором требуются специальные стеклянные микроиглы и влажные камеры. (Палагина Н. К.).

В эту группу включаются методы, основанные на разделении клеток в питательных средах и использовании специфических биологических особенностей отдельных видов для создания преимущественных условий для их роста.

Метод поверхностного посева на агаровые среды. Посевы производят либо из суспензии пипеткой, либо петлей по принципу «истощающего штриха».

Каплю суспензии, содержащей дрожжевые клетки наносят на поверхность застывшей подсохшей среды в чашке Петри. Стерильным стеклянным шпателем равномерно распределяют каплю по поверхности. Этим же шпателем можно еще засеять 2-3 чашки на случай, если в первой будет очень густой рост колоний. Процессы выделения чистой культуры заканчивается пересевом из отдельной, выросшей изолированно колонии в пробирку. Контролем чистоты выделенной культуры служит однородность клеток под микроскопом и однотипность колоний на чашке при последующем рассеве.

Метод рассева на поверхности агаровых сред можно применять как при работе с уже имеющимися культурами при проверке их чистоты, так и при первичном выделении дрожжей из любого субстрата. С целью повышения возможностей избирательного выделения культур дрожжей определенного вида, для рассева используют селективные среды, а при культивировании создают особые температурные условия. (Попова Т.Е., Попова Е.В.).

Для выделения дрожжей родов Brettanomyces и Lipomyces используют их устойчивость к антибиотику актиноиду, добавление которого в среду в концентрации 100-200 мг/л подавляет рост большинства видов других дрожжей.

Выделение чистых культур баллистоспоровых дрожжей. Баллистоспоровые дрожжи легко получить в чистой культуре, используя их способность отбрасывать споры на значительное расстояние. Если после посева на поверхность агаровой среды налить расплавленный агар в крышку чашки Петри и инкубировать ее в перевернутом положении, то через некоторое время на нижней пластинке появятся колонии в результате прорастания отстрелявшихся баллистоспор.

Поддержание и хранение чистых культур дрожжей

Длительное поддержание чистых культур микроорганизмов необходимо как при проведении научно-исследовательских работ, так и в производстве и при хранении в коллекциях.

Из-за различий биологических свойств видов невозможно использовать с равноценными положительными результатами один общий способ хранения для разных культур дрожжей. Большой опыт по хранению культур микроорганизмов, в том числе и дрожжей, накоплен сотрудниками крупных национальных коллекций, в которых имеется возможность проверять и оценивать разные методы хранения применительно к широкому набору дрожжевых организмов.

Наиболее широко применяемый способ – это поддержание культур путем их периодических пересевов. В последние два десятилетия получили распространение также методы хранения микробных культур под минеральным маслом и лиофильная сушка. Так как эти три метода применяются уже много лет, то имеется возможность сравнительной оценки их пригодности для хранения разных видов дрожжей. Другие, менее широко используемые или недавно разработанные методы можно рекомендовать лишь для проверки с обязательным дублированием культур, которые поддерживаются обычными способами. (Семихатова Н. М., Белова М. Ф., Лозенко Л. Д.).

Периодические пересевы

Обычно культуры поддерживают, пересевая их на агаровых средах в двойной повторности. Одна пробирка, которую после засева совсем не открывают, служит контрольной, а из второй по мере надобности делают отсевы.

Частота пересевов. Сроки пересевов определяют для большинства культур дрожжей скоростью высыхания среды. Она зависит от температуры и влажности помещения, где хранят пробирки. В голландской коллекции*, насчитывающей более 6000 штаммов дрожжей, культуры хранят в специально предназначенных для этих целей, в постоянно проветриваемой комнате, где температура поддерживается зимой 18°С, а летом 20°С. Частота пересевов при этих условиях – каждые 5-7мес или пять раз в два года для основной массы культур и более частые для немногих других: например, ежемесячные для Schizosaccharomices japonicas и каждые две недели для Cyniclomyces (=Saccharomycopsis) guttulata.

Промежутки между пересевами можно увеличить за счет более плотного закупоривания пробирок и снижения температуры хранения. Так использование пробирок с завинчивающимися металлическими крышками вместо обычных ватных пробок предохраняет от высушивания, но хуже обеспечивает чистоту сохраняемых культур. Применение вазелинового масла для снижения скорости высыхания культур так же имеет свои недостатки. Поэтому хорошо сделанные ватные пробки(их можно сверху заливать парафином) все же остается лучшим средством закрывания пробирок. Они обеспечивают достаточный газообмен, хорошо предохраняют от микробного загрязнения и легко изготавливаются при помощи специальных машин, которые просты и доступны для любой лаборатории. .( Бабьева И.П., Голубев В. И.).

Ватные пробки, однако, не предохраняют культуры от заражения их микофильными клещами (mites). Для профилактики используют следующий прием. Перед посевами или пересевами культур пробку слегка выдвигают из пробирки и наносят на нее каплю раствора содержащего 10г сулемы, 50мл глицерина, 500мл этилового спирта и 450 мл воды. Затем пробку вдвигают в пробирку и несколько раз проворачивают ее, чтобы смочить внутренние стенки пробирки. В раствор можно добавить какой-либо краситель, для контроля за равномерностью смачивания.

Температура. Если хранение ведется при температуре в пределах 15-20°С , то после пересева пробирки сразу же помещают в коллекционное помещение, за исключением тех культур, которые требуют для роста более высокой температуры. К последним относятся, например, такие виды, как Saccaharomyces castellii и Torulopsis lacctis-condensii которые инкубируют при 30°С, а Candida slooffii, Pityrosporum ovale, P. Pachydermatis, Torulopsis bovina, T. Pintolopesii и Saccharomyces telluris – при 37°С психрофильные дрожжи выращивают и хранят при 3-4°С в холодильнике. Это виды: Candida aquatic, C. curiosa, C. salmonicola и все представители рода Leucosporidium. При низкой температуре после появления хорошего роста можно хранить и все другие дрожжи, за исключением психрофобных видов, ассоциированных с теплокровными животными, и некоторых устойчивых к полиеновым антибиотикам мутантов.

Среды. Во многих лабораториях и коллекциях дрожжи поддерживают и хранят на сусло-агаре. Было показано, однако, что на этой сложной среде при длительном хранении происходит изменение физиологических свойств, характерных для вида, за счет адаптации или стабилизации мутантов. В связи с этим для хранения более пригодна среда следующего состава, (в %):

Глюкоза 4 дрожжевая вода

Пептон 0,5 рН 5,8-6,0

Дрожжевую воду готовят, автоклавируя при 121°С 15 мин суспензию дрожжей (200 г на 1 л водопроводной воды) с небольшим количеством яичного белка. После стерилизации еще горячую воду дважды фильтруют через бумажный фильтр. .( Бабьева И.П., Голубев В. И.).

Пивоваренные дрожжи лучше поддерживать на сусло-агаре или на среде следующего состава (в %): Сусло − 3; Дрожжевой экстракт − 3; Пептон 5; Глюкоза − 1; Агар − 2.

Лучше растут на сусле, чем на глюкозо-пептонной среде, базидомицетовые дрожжи, близкие к головневым грибам.

Липомицеты поддерживают на среде с солодовым и дрожжевыми экстрактами, на которой эти дрожжи лучше сохраняют спорообразующую способность(в г/л.): Глюкоза − 10; Пептон – 5; Сусловый агар – 3; Дрожжевой экстракт – 3 Агар – 20; Водопроводная вода, л – 1.

В некоторых коллекциях дрожжи поддерживают в жидких средах (сусло с дрожжевым автолизатом, пептоном и глюкозой) с пересевами через 4 мес.

Осмотолерантные дрожжи, например Saccaromyces (= Zygosaccaharomyces) rouxii, пересевают на среде с высоким осмотическим давлением, а именно: на сусло-агаре с 50% глюкозы.

Дрожжи родов Brettanomyces и Dekkera сильно подкисляют среду в процессе роста и быстро гибнут, поэтому для их культивирования добавляют в среду 2% СаСО3 и делают пересевы через каждые 2 мес.

Существуют также другие способы хранения чистых культур дрожжевых микроорганизмов.

Хранение под минеральным маслом заливка агаровых культур минеральным маслом с целью задержать высыхание и тем самым увеличить сроки пересевов.

Лиофилизация − процесс высушивания под вакуумом из замороженного состояния.

Методы криогенного хранения − замораживание дрожжей производят при разных режимах, включая температуры от − 10 до − 196°С и различные скорости охлаждения.

Хранение на адсорбентах − в качестве адсорбентов используют почву, песок, коалин, селикагель, вату и фильтровальную бумагу. Этот способ хранения не имеет разработанной стандартной техники.( Семихатова Н. М., Малыгина М. В., Володина Т. И.).

2 Глава Собственные исследования

Схема 1 направления исследования

Сбор хмеля и подготовка его к исследованию

↓

Сушка хмеля

↓

Приготовление смыва

↓

Первичный посев

↓

Инкубирование

↓

Микроскопирование колоний

↓

Получение ЧКД

↓

Идентификация полученных культур

2.1 Материалы и методы исследований

Работа проводилась на кафедре биологической и химической технологии Горского ГАУ, т. к. материально – техническая база позволила провести все необходимые исследования. Материалом для проведения исследований явились: дикий хмель и выделенные из него дрожжи.

Работа включала следующие этапы:

·          выделение штаммов дрожжей;

·          определение видовой принадлежности выделенных дрожжей.

·          экономические расчеты.

Приборы и оборудование

В ходе исследований использовали :

·          Автоклав;

·          Термостат;

·          Холодильник;

·          Шкаф сушильный;

·          Настольный бокс;

·          Микроскоп;

·          Весы ( настольные и аналитические );

·          Различную химическую посуду;

·          Питательные среды и реактивы.

Методы исследований

Поверхность твердого тела исследуют путем получения смыва, отпечатка или соскоба

Смыв производят стерильной водой непосредственно с объекта, помещая его в сосуд или же при больших размерах объекта пользуясь ватными или марлевыми тампонами. Такие тампоны затем опускают в суспензионную жидкость, встряхивают и делают высев. Метод смыва с поверхностей применяют при исследовании таких объектов, как плоды и овощи, зерно и сметана, мясо и шкуры и тому подобное, а также с оборудования. Высев на плотные питательные среды из подготовленной суспензии делают пипеткой, внося в каждую чашку по 0,5 мл или по одной капле измеренного объема. Чашек берут всегда не менее трех для каждого разведения, чтобы получить среднее число колоний на одной чашке После посева чашки инкубируют 24 ч в обычном положении, чтобы агар адсорбировал жидкость, а за тем перевертывают во избежание попадания на поверхность капель конденсата с крышки Подбор температурных условий при выделении дрожжей зависит от источника выделения и целей исследования

Определения проводили по следующим ГОСТам :

·     сухое вещество – высушиванием в сушильном шкафу при температуре 60°С;

·     гигроскопическая влажность – высушиванием в сушильном шкафу при температуре 100 – 105° С, ГОСТ 1396.3 – 92 (27548 - 97);

·     «сырой» жир – в аппарате Сокслета, ГОСТ 13496.65;

·     «сырой» протеин – по методу Къельдаля, ГОСТ 1396.4 (28074 – 89);

·     «сырая» зола – методом сухого озоления (температура 400 – 4500С), ГОСТ 26226 – 95;

·                   БЭВ – расчетным методом.

2.2 Подготовка питательной среды

Среды для дрожжей и грибов

Для выращивания дрожжей, при выполнении эксперимента мы использовали следующие виды питательных сред.

Среда Сабуро. Основой этой среды является дрожжевая вода. На 1 л водопроводной (недистиллированной) воды берут 80 г прессованных пекарских дрожжей (или 20 г сухих дрожжей), кипятят 15 мин, фильтруют через бумажный фильтр, разливают по флаконам и стерилизуют при 1 атм 20 мин. К 100 мл стерильной дрожжевой воды добавляют 1% пептона, 2% агара,

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9