Выделение, изучение свойств микроорганизмов и их использование для выполнения подготовительных процессов переработки овчинно-мехового сырья

Если оптическая плотность превышает максимальное значение калибровочного графика, то отбирают аликвотную часть хлороформного экстракта и разбавляют хлороформом. Таким же образом разбавляют и раствор холостого опыта.

Калибровочный график представлен на рис. 2.

Содержание анионактивных СПАВ определяют по формуле (4):

С´1000

Х= –, (4)

V

где Х-содержание аниононактивных СПАВ, мг/см3;

С-содержание СПАВ, найденное по калибровочному графику, мг;

V – объем сточной воды, взятый для анализа, см3;

1000-перевод в дм3.

Неионогенный СПАВ реагирует с роданокобальтом аммония, образуя комплексные вещества синей окраски, растворимые в хлороформе, роданокобальтата аммония в хлороформе нерастворим. Чувствительность реакции невелика, но поскольку определяемые вещества нелетучи, возможно предварительное концентрарование путем выпаривания анализируемой воды досуха и растворением остатка в спирте и воде.

Приготовление стандартного раствора: 1 г применяемого неионогенного СПАВ растворяют в дистиллированной воде и доводят объем до 500 см3.

Построение калибровочного графика: отбирают 0; 0,5; 1; 2; 3; 4 и 5 cм3 стандартного раствора, доводят объем до 5 см3 и переносят в ряд делительных воронок вместимостью 50 см3, в которые предварительно налито по 20 см3 раствора роданокобальтата аммония. Содержимое воронки взбалтывают 1 минуту и дают постоять 5 минут. Затем прибавляют 4 см3 хлороформа, взбалтывают 1 минут и оставляют до расслаивания жидкости. Слой хлороформа сливают через воронку, в которую предварительно вкладывают кусочек ваты, пропитанный хлороформом, в калибровочную пробирку вместимостью 10 см3. Извлечение окрашенного комплекса повторяют дважды, используя порции хлороформа объемом 4 и 2 см3 и, собирая хлороформные экстракты в ту же пробирку. Пробирку опускают на 5 минут в водяную баню при температуре 200С и, если надо, доливают хлороформ до метки и перемешивают.

Оптические плотности полученных хлороформных экстрактов определяют на фотоколориметре с оранжевым светофильтром (l=610 нм) в кюветах с толщиной поглощающего слоя 30 мм. По полученным данным строят калибровочный график зависимости оптической плотности от содержания неионогенного СПАВ.

Калибровочный график представлен на рис. 3.

Содержание неионогенного СПАВ определяют по формуле (5):

С´1000

Х= –, (5)

V

где Х-содержание неиногенного СПАВ, мг/дм3;

С-содержание неионогенного вещества, найденное по калибровочному графику, мг;

V – объем сточной воды, взятый для анализа (с учетом разбавления или упаривания), см3;

1000-перевод в дм3.

2.2.13 Определение рН жидкости

Для измерения рН жидкости используется цифровой ионометр И-120.2. Входное напряжение прибора 220 В, частота 50 Гц. Ионометр предназначен для измерения рН жидкой фазы, температуры, С, градиента, %.

Измерение рН проводили следующим образом: химический стакан на 50 мл наливали 35 мл жидкости исследуемого раствора, погружали электроды, снимали показания. После этого промывали дистиллированной водой и протирали фильтровальной бумагой.

2.2.14 Качественный анализ вещества по ИК-спектрам поглощения

При измерении ИК-спектра твердого вещества работа ведется в следующей последовательности:

– из предварительно высушенного вещества (3–5 мг) готовят суспензию в виде пасты (растирают вещество с несколькими каплями вазелинового масла);

– количественно переносят на нижнюю крышку кюветы. Кювету закрывают в держателе и устанавливают в канале спектрофотометра. Записывают спектральные вещества в диапазоне от 4200 до 1200 см-1.

2.2.15 Отбор проб методом асимметрической бахромы

Для сопоставимости результатов исследований различных факторов или технологических параметров необходимо исключить влияние топографии шкуры, полуфабриката или кожи. В этом случае для отбора средней пробы пользуются методом ассиметрической бахромы (МАБ), который заключается в следующем. Намечают необходимое число вариантов исследования и задаются числом образцов (полосок), входящих в группу, предназначаемую для каждого варианта (обычно не менее 4). Чем больше число образцов, тем более достоверным будет среднее значение, характеризующее вариант. Размер образца предопределяется набором физико-механических или физических испытаний, которые предполагается провести, а все образцы должны уложиться в прямоугольник, вписанный в чепрачную часть (рис. 4).

Отбор проб методом асимметрической бахромы

Рис. 4

2.2.16 Определение содержания несвязанных жировых веществ в волосяном покрове и кожевой ткани

ГОСТ 26129–84. Шкурки меховые и овчина шубная выделанные. Метод определения содержания несвязанных жировых веществ.

Навеску измельченной кожевой ткани или волоса массой 0,5–1,5 г, взвешенную с погрешностью не более 0,0002 г., помещают в бумажную или стеклянную гильзу и закрывают тампоном. Гильзу закрепляют в предварительно доведенной до постоянной массы колбе и соединяют колбу с холодильником. Через воронку с ватным тампоном, помещенную в верхнее отверстие холодильника заливают 50 см3 дихлорэтана или хлороформа, нижняя часть гильзы должна быть не расстоянии не менее 10 мм от поверхности растворителя. Колбу с растворителем нагревают на электроплитке с асбестовым покрытием или песчаной бане. Продолжительность экстрагирования при анализе кожевой ткани – 45 мин., при анализе волоса – 15–20 мин. Растворитель должен постоянно кипеть и, охлаждая и стекая с холодильника, попадать в центр гильзы. Растворитель отгоняют холодильника, попадать в центр гильзы. Растворитель отгоняют и колбу с жировыми веществами доводят до постоянной массы в сушильном шкафу при температуре 128–1300С. Продолжительность 1-ой сушки – 30 мин., последних по 15 мин.

При определении несвязанных жировых веществ гравиметрическим методом массовую долю жировых веществ (Х) в% вычисляют по формуле (6):

                   m-m1

Х=     – ´ 100, (6)

                   m2

где Х – массовая доля жировых веществ, %;

m – масса колбы с экстрагированными жировыми веществами, г;

m1 – масса пустой колбы, г;

m2 – масса навески кожевой ткани или волоса, г.

2.2.17 Определение прочности связи волоса с кожевой тканью

Образец размером 100´25 мм, вырезанный из огузочной части овчины, отмывают в проточной воде, отжимают и разрезают на ремешки размером 25´10 мм. В середине ремешка ограничивают полоску волоса, равную 5 мм. Это достигается путем применения специальной вилки с двумя параллельными иглами, находящимися на расстоянии 5 мм. Вилку вдвигают в волосяной покров как можно ближе к кожевой ткани и ограничивают полоску волоса шириной 5 мм. Перед испытанием ремешки выдерживают в воде при комнатной температуре с добавлением кальцинированной соды из расчета 5 г/дм3. После обводнения образца удаляют избыток влаги фильтровальной бумагой и приступают к испытанию.

2.2.18 Определение показателя белизны волосяного покрова меховой овчины

Показатель белизны волосяного покрова определяют на спектроколориметре «Пульсар». Для проверки работоспособности прибора необходимо:

1) включить прибор и нажать кнопку «СБРОС», на дисплее прибора высветятся символы «Ч» и «С», на индикаторах режима и вывода – «0»,

2) нажать на кнопку «ПУСК», через 10 с на левом и среднем индикаторах дисплея высветятся символы «Б» и «С» соответственно,

3) нажать на кнопку «ПУСК», через 10 с на левом индикаторе дисплея символ «Б» заменится на «I», соответствии индикации на дисплее прибора значениям индикатора проверяется по таблице.

Для смены значения цифр на индикаторе режима необходимо нажать на кнопку «УСТ.РЕЖИМА».

4) Перед измерениями прибор необходимо прогреть в течение 30 минут.

Порядок измерения:

1) Установить на индикаторе режима цифру «2», на индикаторе вывода цифру «3».

2) Установить на место установки отражающего образца измеряемый образец и запустить прибор.

3) По окончании измерения на индикаторах дисплея высветятся значения координат цветности, Х, Y и яркость измеряемого образца.

2.2.19 Определение токсичности сточных вод

В качестве тест-объектов можно использовать следующие организмы: дафнии (Daphnia magna Straus); большой прудовик (Limnaca stagnalis) и гуппи (Lebistes reticulatus). Установление уровня токсического загрязнения (УТЗ) водных масс по данным биотестирования на дафниях представлены в табл. 2.

Таблица 2. Установление УТЗ водных масс по данным биотестирования на дафниях

К первому классу – весьма остротоксичному – относится вода, если все организмы погибают в ней в течение суток или менее; ко 2 классу – вода остро токсична, все организмы погибают в течение пяти суток; к 3 классу – токсичному, если в течение пяти суток гибель дафний достигает 70–100%; к 4 классу – мало токсичному, если гибель дафний не превышает 30%; к 5 классу – условно нетоксичному, если по истечении 5 суток все организмы выживают и по внешнему состоянию или поведению не отличаются от контрольных.

Выполнение работы. В сосуд с очищенной исследуемой жидкостью запускают тест-объект и проводят визуальную оценку его физического состояния в течение 5 суток. На основании полученных результатов проводится оценка токсичности воды. В качестве критерия токсичности используется параметр выживаемости тест-объекта.

2.2.20 Обработка результатов эксперимента

Обработка результатов эксперимента производилась по программе «OTSEV-12». Этот метод основан на рассмотрении стандартного отклонения. По программе можно обрабатывать результаты эксперимента при количестве данных от 3 до 20. Это обусловлено тем, что в подпрограммах приведены табличные значения критерия Стьюдента от 3 до 20. В программе используются табличные значения критерия Стьюдента. В программе возможна проверка грубых ошибок только двух значений (максимального и минимального). Расчет по программе «OTSEV-12» производится по формулам, приведенным ниже.

Среднеквадратичное отклонение определяют по формуле (7):

                             (å хi2) – [(åxi)2 / N]

s =              ––––––––––––––, (7)

                                       N – 1

где s – среднеквадратичное отклонение;

хi – измеренная величина;

N – количество параллельных опытов.

Коэффициент вариации определяется по формуле (8):

                   s

Кв = –––––––––– ´ 100, (8)

                   х

где Кв – коэффициент вариации, %;

s – среднеквадратичное отклонение;

х – среднее арифметическое значение.

Относительная погрешность определяется по формуле (9):

Е = Е1 – Е2, (9)

где Е – относительная погрешность, %;

Е1 – систематические погрешности измерений, %;

Е2 – случайные погрешности измерений, %.

Относительная ошибка измерения определяется по формуле (10):

                   s0 ´ tт

D = –––––––––, (10)

                   Х

где D – относительная погрешность, %;

s0 – стандартное отклонение среднего;

Е – погрешность измерения, %;

tт – табличное значение коэффициента (критерия) Стъюдента.

Доверительный интервал определяется по формуле (11):

m = s0 ´ tт (11)

где m – доверительный интервал;

s0 – стандартное отклонение среднего;

tт – табличное значение коэффициента (критерия) Стъюдента.

3. Экспериментальная часть

Одной из важных проблем мехового производства является снижение загрязнения сточных вод синтетическими поверхностно-активными веществами. Поступая в нативные водные объекты, СПАВ изменяют кислородный режим вод, вызывая гибель организмов. Решение этой проблемы особенно актуально в Байкальском регионе.

В настоящее время наиболее перспективным является использование биотехнологических методов, основанных на применении микроорганизмов с заданными свойствами, что позволяет уменьшить уровень техногенного воздействия на окружающую среду.

Высокая степень загрязнения сточных вод после процесса обезжиривания меховой овчины объясняется высокой начальной концентрацией СПАВ – 8 г/дм3 и формальдегида, являющегося токсичным и для человека, и для гидробионтов.

Одним из способов, позволяющих снизить уровень токсического загрязнения сточных вод, является совершенствование технологического процесса путем разработки новых обезжиривающих составов, позволяющих решить данную проблему при сохранении качества готовой продукции.

В связи с этим целью данной работы являлась разработка условий проведения совмещенного эмульсионного и микробиологического обезжиривания, основанного на применении концентрированного ферментного препарата, продуцируемого культурами рода Listeria. Исследуемые культуры были выделены из сточных вод после эмульсионного обезжиривания меховой овчины. Для получения ферментного препарата проведена его адаптация на синтетических средах, где в качестве единственного источника углерода были использованы синтетические поверхностно-активные вещества. В синтетическую среду вводили СПАВ различной химической природы: анионактивные – Гамма, De-sol-A, неионогенные – Превоцелл W-OF-7, Wetter HAC.

3.1 Изучение морфолого-физиологических и культуральных свойств микроорганизмов

Целью данного этапа эксперимента являлось выделение, изучение свойств микроорганизмов и определение их видовой принадлежности. Исследуемые культуры были выделены из сточной воды после эмульсионного обезжиривания меховой овчины. Изучаемые культуры были обозначены номерами 3,7, F, G, I, I¢. Получение чистых культур прокариотических микроорганизмов проводили путем изолирования отдельных клеток на плотной питательной среде, используя метод посева штрихом и метод разведения. Для получения чистых культур методом посева штриха, петлей с культурой зигзагом наносили на поверхность среды. Синтетическую среду готовили в соответствии с п. 2.2.1. с иcпользованием в качестве источника углерода СПАВ «Превоцелл-W-OF-7» в количестве 1 г/л. Для получения единичных колоний методом разведения в чашки Петри вносили 0,1 см3 разведенной культуры и равномерно распределяли с помощью стеклянного шпателя по всей поверхности. Чашки Петри с культурами инкубировали в перевернутом виде в термостате в течение 24 ч при постоянной температуре (38±0,5)0С.

В ходе эксперимента готовили синтетические среды с содержанием импортного и отечественного агар-агара в соотношении 1:1 и 1,5:0,5. Агар-агар отечественного производства содержит большое количество органической примеси, которая служит дополнительным источником питания микроорганизмов, а в импортном – практически отсутствуют. Для восстановления жизненно важных функций и определения морфолого-физиологических свойств микроорганизмов методом 10-ти кратного разведения культуры пересевали на чашки Петри, где в качестве питательной среды использовали мясопептонный агар (МПА).

Синтетические среды с содержанием 1:1 и 1,5:0,5 импортного и отечественного агар-агара обозначили буквами В и С соответственно, а мясопептонный бульон-А. Изменение культуральных свойств в зависимости от вида питательной среды представлено в табл. 3.

Как видно из данных, представленных в табл. 3, с изменением состава синтетической среды (с В на С) колоний практически не изменяется и колеблется от белого до желтоватого. Форма колоний – круглая, но с уменьшением содержания органической примеси у культур I и I’ форма оставалась без изменений, но с валиком по краям и фестончатым краем соответственно. Профиль и поверхность колоний не менялись. У культур I и I’ размеры переходят от точечных до средней величины. А также структура колоний I’ переходит из однородной (среда В) в мелкозернистую (среда С).

На МПА культуры имели, в основном, круглую форму, но с разнообразными краями – гладкими (колонии 3, F, G) и ворсистыми (7, I, I’). Поверхность выросшие культуры имели гладкую, за исключением F, I (шероховатая). Все колонии имели точечные размеры (диаметр менее 1 мм), кроме I (средней величины d>1 мм). Цвет изменяется от белого до желтого. Структура колоний 3,7, G была однородной, а у культур F, I, I’ – мелкозернистой. Из табл. 3 видно, что с изменением соотношения агар-агара импортного и отечественного производства lg КОЕ снижается. Так, например, для культуры 3 данный показатель уменьшается с 7,62 до 6,48. На среде МПА максимальный lg КОЕ наблюдается у культуры 3 (27,82), а минимальный – у I’ (18,04).

Далее определяли такие морфолого-физиологические признаки микроорганизмов, как спорообразование, подвижность, разжижение желатина, наличие сероводорода, аммиака, каталазы, а также редуцирующую способность. Данные определений представлены в табл. 4.

Далее провели исследования колоний на тинкториальную способность (окраска по Граму и подвижность). Окраска по Граму является дифференциально-диагностической и зависит от содержания в клеточной стенке гликолипида муреина, представляющего собой гетерополимер, который в свою очередь состоит из чередующихся остатков N-ацетилглюкозоамина и N – ацетилмурамовой кислоты и пептидов. Грамположительная окраска указывает на наличие небольшого количества полисахаридов, липидов и белков и характерна для всех выделенных культур. Исследование подвижности показало, что для микроорганизмов типа 3,7, I характерен лофотрихиальный тип движения, культуре F – перетрихиальный, G – монотрихиальный. А для культуры I’ характерен как монотрихиальный, так и лофотрихиальный тип движения.

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11