Клонирование и анализ генов легких цепей иммуноглобулинов стерляди

          Ýëåêòðîòðàíñôîðìàöèÿ.

          Äëÿ ïîäãîòîâêè êîìïåòåíòíûõ êëåòîê E.coli øòàìì XL-1 Blue MRF ' âûðàùèâàëè â 100 ìë ñðåäû LB (ñì. Õèìè÷åñêàÿ òðàíñôîðìàöèÿ) ïðè êîìíàòíîé òåìïåðàòóðå äî îïòè÷åñêîé ïëîòíîñòè D550=0,45. Çàòåì êëåòêè îñàæäàëè öåíòðèôóãèðîâàíèåì ïðè 4000 g, 4îÑ è ïðîìûâàëè ñóñïåíäèðîâàíèåì ïîñëåäîâàòåëüíî â 100 ìë, 50 ìë è 10ìë 10% ðàñòâîðà ãëèöåðèíà ïðè 0-4îÑ. Ïîñëå ýòîãî êëåòêè ñóñïåíäèðîâàëè â 240 ìêë ëåäÿíîãî ðàñòâîðà GYT (10% ãëèöåðèí, 0,125% áàêòî-äðîææåâîé ýêñòðàêò, 0,25% áàêòî-òðèïòîí).

          Äëÿ òðàíñôîðìàöèè ê 40 ìêë ñóñïåíçèè êîìïåòåíòíûõ êëåòîê äîáàâëÿëè 1 ìêë ÄÍÊ âåêòîðà (50 íã) ïðè 0-4îÑ è ïðîïóñêàëè ýëåêòðè÷åñêèé ðàçðÿä (U=18000 Â). Çàòåì äîáàâëÿëè 1 ìë SOC (2% áàêòî-òðèïòîí, 0,5% áàêòî-äðîææåâîé ýêñòðàêò, 10 ìÌ NaCl, 2,5 ìÌ KCl, 10 ìÌ MgCl2, 10 ìÌ MgSO4, 20 ìÌ ãëþêîçà), ïåðåìåøèâàëè, ïåðåíîñèëè â 3 ìë ñðåäû SOC, ïðîãðåòîé äî 42îÑ, è èíêóáèðîâàëè ïðè 37îÑ â òå÷åíèå 1 ÷àñà (Wai Lin Tung and King-C. Chow, 1995).

            ÂÛÄÅËÅÍÈÅ ËÅÉÊÎÖÈÒÎÂ ÈÇ ÊÐÎÂÈ ÐÛÁ

          Êðîâü ñîáèðàëè íà õîëîäó ÷åðåç êàóäàëüíóþ àðòåðèþ ñ äîáàâëåíèåì íà êàæäûå 5 ìë êðîâè 1 ìë 2,7% ðàñòâîðà Na2ÝÄÒÀ, ðÍ 7,4. Ê âûäåëåííîé êðîâè äîáàâëÿëè ðàâíûé îáúåì òðèñ-ñîëåâîãî áóôåðà (TBS) (0,14 Ì NaCl, 5 ìÌ KCl, 25 ìÌ òðèñ-HCl, ðÍ 7,4). Ñìåñü íàíîñèëè ïðè êîìíàòíîé òåìïåðàòóðå íà ðàâíûé îáúåì ñðåäû äëÿ âûäåëåíèÿ ëåéêîöèòîâ, ñîäåðæàùåé 24 ÷àñòè 9% ôèêîëà è 10 ÷àñòåé 34% âåðîãðàôèíà. Ïîñëå öåíòðèôóãèðîâàíèÿ ïðè 400 g â òå÷åíèå 30 ìèí îòáèðàëè ñëîé ëåéêîöèòîâ è ðàçâîäèëè â áîëüøîì îáúåìå áóôåðà TBS. Ïîñëå ïîâòîðíîãî öåíòðèôóãèðîâàíèÿ ïðè 300 g â òå÷åíèå 40 ìèí äëÿ ëèçèñà îñòàòî÷íûõ ýðèòðîöèòîâ êëåòêè ñóñïåíäèðîâàëè â ðàñòâîðå, ñîäåðæàùåì 9 îáúåìîâ 0,83% ðàñòâîðà NH4Cl è 1 îáúåì 2,06% ðàñòâîðà òðèñ-HCl, ðÍ 7,62, äî êîíöåíòðàöèè 108 êë/ìë è äîáàâëÿëè 5 îáúåìîâ ñðåäû. Ïîñëå îñàæäåíèÿ êëåòîê ïðè 300 g â òå÷åíèå 10 ìèí ïðîöåäóðó î÷èñòêè ïîâòîðèëè (Ôðèìåëü, 1987).

            ÂÛÄÅËÅÍÈÅ ÑÓÌÌÀÐÍÎÉ ÐÍÊ ÈÇ ËÅÉÊÎÖÈÒÎÂ

          Îñàäîê ëåéêîöèòîâ ïîñëå âûäåëåíèÿ è î÷èñòêè ñóñïåíäèðîâàëè â 10 îáúåìàõ (1 ìë) ðàñòâîðà 1, ñîäåðæàùåãî 4 Ì ãóàíèäèí òèîöèàíàò, 25 ìÌ öèòðàò íàòðèÿ, ðÍ 7,0, 0,5% ñàðêîçèë è 0,1 Ì 2-ìåðêàïòîýòàíîë, ïðè êîìíàòíîé òåìïåðàòóðå. Çàòåì äîáàâëÿëè 0,1 ìë 2 Ì ðàñòâîðà NaAc, ðÍ 4,0, 1 ìë ôåíîëà, 0,2 ìë õëîðîôîðìà è ïåðåìåøèâàëè. Çàòåì öåíòðèôóãèðîâàëè ïðè 10000 g â òå÷åíèå 20 ìèí ïðè 4îÑ, îòáèðàëè âîäíóþ ôàçó, äîáàâëÿëè ê íåé ðàâíûé îáúåì èçîïðîïàíîëà è îñàæäàëè ÐÍÊ öåíòðèôóãèðîâàíèåì ïðè 15000 g â òå÷åíèå 15 ìèí ïðè 4îÑ (Chomczynski and Sacchi, 1987).

            ÂÛÄÅËÅÍÈÅ ÂÛÑÎÊÎÌÎËÅÊÓËßÐÍÎÉ ÄÍÊ ÈÇ ÝÓÊÀÐÈÎÒÈ×ÅÑÊÈÕ ÊËÅÒÎÊ

          1 ã ïå÷åíè ñòåðëÿäè, çàìîðîæåííîé â æèäêîì àçîòå, ðàñòèðàëè â òîíêèé ïîðîøîê è ãîìîãåíèçèðîâàëè â 15 ìë ðàñòâîðà, ñîäåðæàùåãî 0,5 Ì Na2ÝÄÒÀ, ðÍ 8,0, 0,5% ñàðêîçèëà, 100 ìêã/ìë ïðîòåèíàçû Ê è íàãðåòîãî äî 65îÑ. Çàòåì èíêóáèðîâàëè ïðè 50îÑ òå÷åíèå 3 ÷àñîâ ïðè ëåãêîì ïîêà÷èâàíèè. Çàòåì, èçáåãàÿ ðåçêèõ âñòðÿõèâàíèé, ýêñòðàãèðîâàëè ÄÍÊ ðàâíûì îáúåìîì ôåíîëà òðè ðàçà, êàæäûé ðàç ðàçäåëÿÿ ôðàêöèè öåíòðèôóãèðîâàíèåì ïðè 4000 g è êîìíàòíîé òåìïåðàòóðå. Ôåíîë ïðåäâàðèòåëüíî î÷èùàëè ïåðåãîíêîé è íàñûùàëè áóôåðîì, ñîäåðæàùèì 1 Ì òðèñ-HCl, îäèí ðàç è äâà ðàçà áóôåðîì, ñîäåðæàùèì 0,1 Ì òðèñ-HCl è 0,1% 2-ìåðêàïòîýòàíîë. Äèàëèç ÄÍÊ ïðîâîäèëè ïðè 10îÑ â òå÷åíèå 12 ÷àñîâ ïðîòèâ 4 ë áóôåðà, èìåþùåãî ñîñòàâ:

  50 ìÌ òðèñ-HCl, ðÍ 8,0,

  10 ìÌ Na2ÝÄÒÀ,

  10 ìÌ NaCl.

          Çàòåì îáðàáàòûâàëè ïðîáó ÐÍÊàçîé, ñâîáîäíîé îò ÄÍÊàçû,ïðè 37îÑ â òå÷åíèå 1 ÷àñà â êîíöåíòðàöèè 100 ìêã/ìë. Ïîñëå ýòîãî ýêñòðàãèðîâàëè ÄÍÊ ðàâíûì îáúåìîì ñìåñè ôåíîë-õëîðîôîðì (1:1) äâà ðàçà è ïðîâîäèëè äèàëèç ïðè 10îÑ â òå÷åíèå 36 ÷àñîâ ïðîòèâ 10 ë áóôåðà TE (10 ìÌ òðèñ-HCl, 1 ìÌ Na2ÝÄÒÀ, ðÍ 7,5), ìåíÿÿ áóôåð ÷åðåç êàæäûå 12 ÷àñîâ (Ìàíèàòèñ è äð., 1984).

            ÊÎÍÑÒÐÓÈÐÎÂÀÍÈÅ ÁÈÁËÈÎÒÅÊÈ êÄÍÊ

          Âûäåëåíèå ïîëè(A)+ÐÍÊ.

          Äëÿ èíãèáèðîâàíèÿ ÐÍÊàçû âñå ðàñòâîðû, íå ñîäåðæàùèå òðèñ, îáðàáàòûâàëè 0,1% äèýòèëïèðîêàðáîíàòîì 12 ÷àñîâ ïðè 37îÑ è àâòîêëàâèðîâàëè. Ïîñóäó ïðîêàëèâàëè ïðè 250îÑ â òå÷åíèå 4 ÷àñîâ. Ïîëè(A)+ÐÍÊ âûäåëÿëè èç ñóììàðíîé ÐÍÊ ëåéêîöèòîâ ñòåðëÿäè ìåòîäîì õðîìàòîãðàôèè íà îëèãî(dT)-öåëëþëîçå. Äëÿ ýòîãî ÐÍÊ ðàñòâîðÿëè â âîäå, ïðîãðåâàëè ïðè 65îÑ â òå÷åíèå 5 ìèí, äîáàâëÿëè ðàâíûé îáúåì 2-êðàòíîãî áóôåðà äëÿ íàíåñåíèÿ ÐÍÊ (40 ìÌ òðèñ-HCl, ðÍ 7,6, 1 Ì NaCl, 2 ìÌ Na2ÝÄÒÀ, 0,2% SDS) è òðèæäû ïðîïóñêàëè ÷åðåç êîëîíêó ñ îëèãî(dT)-öåëëþëîçîé. Çàòåì ïðîìûâàëè êîëîíêó 5-10 îáúåìàìè áóôåðà äëÿ íàíåñåíèÿ è 4 îáúåìàìè ýòîãî æå áóôåðà, ñîäåðæàùåãî 0,1 Ì NaCl. Ïîñëå ýòîãî ýëþèðîâàëè ïîëè(A)+ÐÍÊ â 2-3 îáúåìàõ âîäû, îáðàáîòàííîé äèýòèëïèðîêàðáîíàòîì, äîáàâëÿëè 2,2 îáúåìà ýòàíîëà è îñàæäàëè öåíòðèôóãèðîâàíèåì â òå÷åíèå 10 ìèí ïðè 12000 g ïðè 4îÑ (Ìàíèàòèñ è äð., 1984).

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17