Клонирование и анализ генов легких цепей иммуноглобулинов стерляди

  6-êðàòíûé SSC (0.9 Ì NaCl, 0,09 Ì öèòðàò íàòðèÿ),

  5-êðàòíûé ðàñòâîð Äåíõàðäòà (0,1% áû÷èé ñûâîðîòî÷íûé àëüáóìèí, 0,1% ôèêîë, 0,1% ïîëèâèíèëïèðîëèäîí),

  0,5% SDS,

  10% äåêñòðàí ñóëüôàò,

  500 ìêã äåíàòóðèðèðîâàííîé ÄÍÊ öûïëåíêà,

è èíêóáèðîâàëè 1 ÷àñ ïðè 55îÑ. Ïîñëå ýòîãî äîáàâëÿëè ìå÷åíóþ 32P-äATÔ ÄÍÊ çîíäà è èíêóáèðîâàëè 12-18 ÷àñîâ ïðè 55îÑ ïðè ïîñòîÿííîì ïîêà÷èâàíèè.

          Ïîñëå ãèáðèäèçàöèè ïðîâîäèëè ïðîìûâàíèå ìåìáðàíû äâà ðàçà ïî 10 ìèí â 200 ìë 2-êðàòíîãî SSC + 0,1% SDS ïðè êîìíàòíîé òåìïåðàòóðå, 15 ìèí â 1-êðàòíîì SSC + 0,1% SDS% ïðè 55îÑ è äâà ðàçà ïî 10 ìèí â 0,1-êðàòíîì SSC + 0,1% SDS ïðè 55îÑ. Ýêñïîíèðîâàíèå ïðîâîäèëîñü â òå÷åíèå 12 ÷àñîâ ïðè -70îÑ ñ ðåíòãåíîâñêîé ïëåíêîé (Ìàíèàòèñ è äð., 1984).

            ÎÏÐÅÄÅËÅÍÈÅ ÍÓÊËÅÎÒÈÄÍÎÉ ÏÎÑËÅÄÎÂÀÒÅËÜÍÎÑÒÈ ÄÍÊ

          Íóêëåîòèäíóþ ïîñëåäîâàòåëüíîñòü ÄÍÊ îïðåäåëÿëè ïî ìåòîäó Ñýíãåðà (Sanger et al., 1977). 5 ìêã ïëàçìèäíîé ÄÍÊ, î÷èùåíîé ãåëü-ôèëüòðàöèåé íà êîëîíêå ñ áèîãåëåì Ï-10, äåíàòóðèðîâàëè â 50 ìêë 0.2 Ì NaOH ïðè 37îÑ â òå÷åíèå 30 ìèí, çàòåì äîáàâëÿëè 5 ìêë 3 Ì NaAc, ðÍ 5,1, äâîéíîé îáúåì ýòàíîëà è èíêóáèðîâàëè 30 ìèí ïðè òåìïåðàòóðå -70îÑ. Ïîñëå ýòîãî îñàæäàëè ÄÍÊ öåíòðèôóãèðîâàíèåì ïðè 12000 g â òå÷åíèå 12 ìèí è ïðîìûâàëè îñàäîê 100 ìêë 80% ýòàíîëà. Îñàäîê ÄÍÊ âûñóøèâàëè ïðè êîìíàòíîé òåìïåðàòóðå è ðàñòâîðÿëè â 7,5 ìêë âîäû, äîáàâëÿëè 2 ìêë 5-êðàòíîãî áóôåðà (200 ìÌ òðèñ-HCl, ðÍ 7,5, 100 ìÌ MgCl2, 250 ìÌ NaCl), 0,5 ìêë ïðàéìåðà (50 íã) è èíêóáèðîâàëè 30 ìèí ïðè 37îÑ. Ïîñëå ýòîãî ïðîáèðêó ïîìåùàëè â ëåä è äîáàâëÿëè 1 ìêë 0,1 Ì ÄÒÒ, 2 ìêë 1,5 ìêÌ äÍTÔ áåç äATÔ, 0,5 ìêë ðàñòâîðà 35S-äATÔ è 2 ìêë ÄÍÊ ïîëèìåðàçû ôàãà Ò7 (2,5 å.à./ìêë). Çàòåì èíêóáèðîâàëè 3 ìèí ïðè 20îÑ è ñðàçó îòáèðàëè ïî 3,5 ìêë â ÷åòûðå ïðîáèðêè, êàæäàÿ èç êîòîðûõ ñîäåðæàëà ïî 2,5 ìêë 80 ìêÌ ñìåñè ÷åòûðåõ äÍTÔ, 50 ìÌ NaCl è 8 ìêÌ îäíîãî èç ääÍTÔ. Èíêóáèðîâàëè 5 ìèí ïðè 37îÑ è äîáàâëÿëè ïî 4 ìêë ñòîï-ðàñòâîðà (95% ôîðìàìèä, 20 ìÌ Na2ÝÄÒÀ, 0,05% áðîìôåíîëîâûé ñèíèé, 0,05% êñèëåí öèàíîë). Ïîëó÷åííûå îáðàçöû èíêóáèðîâàëè 3 ìèí ïðè 100îÑ, áûñòðî îõëàæäàëè äî 0îÑ è îòáèðàëè ïî 2 ìêë äëÿ ýëåêòðîôîðåçà â äåíàòóðèðóþùåì ïîëèàêðèëàìèäíîì ãåëå, èìåþùåì ñîñòàâ:

  6% àêðèëàìèä,

  8 Ì ìî÷åâèíà,

  1-êðàòíûé ãëèöåðèí-òîëåðàíòíûé áóôåð (1,1% òðèñ, 0,36% òàóðèí, 0,02% Na2ÝÄÒÀ).

          Ýëåêòðîôîðåç ïðîâîäèëè ïðè íàïðÿæåíèè 40 Â/ñì. Çàòåì ãåëü âûäåðæèâàëè 30 ìèí â 10% óêñêñíîé êèñëîòå, âûñóøèâàëè è ýêñïîíèðîâàëè 12 ÷àñîâ ïðè êîìíàòíîé òåìïåðàòóðå ñ ðåíòãåíîâñêîé ïëåíêîé (Ìàíèàòèñ è äð., 1984).

            ÑÀÓÇÅÐÍ ÁËÎÒ ÃÈÁÐÈÄÈÇÀÖÈß

          10 ìêã ãåíîìíîé ÄÍÊ, âûäåëåííîé èç ïå÷åíè ñòåðëÿäè, èíêóáèðîâàëè â òå÷åíèå 2 ÷àñîâ ñ ýíäîíóêëåàçàìè ðåñòðèêöèè Pst I è Pvu II (ïî 50 å.à.) ïðè 37îÑ â áóôåðå, ñîäåðæàùåì 100 ìÌ NaCl, 10 ìÌ òðèñ-HCl, ðÍ 7,5, 10 ìÌ MgCl2, 100 ìêã/ìë áû÷èé ñûâîðîòî÷íûé àëüáóìèí, 6 ìÌ 2-ìåðêàïòîýòàíîë. Çàòåì ýêñòðàãèðîâàëè ÄÍÊ ïîñëåäîâàòåëüíî ðàâíûìè îáúåìàìè ôåíîë-õëîðîôîðìà (1:1) è õëîðîôîðìà, îñàæäàëè ÄÍÊ äâóìÿ îáúåìàìè ýòàíîëà, ðàñòâîðÿëè â âîäå è íàíîñèëè íà 1% àãàðîçíûé ãåëü. Ýëåêòðîôîðåç ïðîâîäèëè ïðè íàïðÿæåíèè 1 Â/ñì è òåìïåðàòóðå 12îÑ â òå÷åíèå 12 ÷àñîâ. Çàòåì ãåëü èíêóáèðîâàëè ïðè êîìíàòíîé òåìïåðàòóðå 30 ìèí â 0,25 Ì HCl, 30 ìèí â äåíàòóðèðóþùåì ðàñòâîðå (0,5 Ì NaOH, 1,5 M NaCl) è 10-15 ìèí â ðàñòâîðå 1 (0,25 Ì NaOH, 1,5 M NaCl). Ïîñëå ýòîãî ÄÍÊ ïåðåíîñèëè íà íåéëîíîâóþ ìåìáðàíó ìåòîäîì âàêóóìíîãî ïåðåíîñà â ðàñòâîðå 1. Ìåìáðàíó ñïîëàñêèâàëè â 2-êðàòíîì SSC, âûñóøèâàëè è ôèêñèðîâàëè ÄÍÊ â òå÷åíèå 10 ìèí óëüòðàôèîëåòîâûì èçëó÷åíèåì ñ äëèíîé âîëíû 310 íì.

          Ïðåäãèáðèäèçàöèþ ïðîâîäèëè ïðè 55îÑ â òå÷åíèå 1 ÷àñà â ðàñòâîðå 1 (ñì. Ñêðèíèíã áèáëèîòåêè êÄÍÊ). Ãèáðèäèçàöèÿ äëèëàñü 12-16 ÷àñîâ ïðè 55îÑ ñ êîíöåíòðàöèåé çîíäà íå áîëåå 10 íã/ìë.

          Îòìûâêó ïðîâîäèëè äâà ðàçà ïî 10 ìèí â 2-êðàòíîì SSC + 0,1% SDS ïðè êîìíàòíîé òåìïåðàòóðå è îäèí ðàç 15 ìèí â 1-êðàòíîì SSC + 0,1% SDS ïðè 55îÑ. Ýêñïîíèðîâàíèå äëèëîñü 12 ÷àñîâ ïðè -70îÑ (Ìàíèàòèñ è äð., 1984).

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17