Клонирование и анализ генов легких цепей иммуноглобулинов стерляди

          Çàìîðàæèâàíèå - îòòàèâàíèå.

          Àãàðîçíûé ãåëü ñ ÄÍÊ  10 ìèí èíêóáèðîâàëè â æèäêîì àçîòå è îñàæäàëè öåíòðèôóãèðîâàíèåì ïðè 12000 g â òå÷åíèå 15 ìèí, ïîñëå ÷åãî äîáàâëÿëè ê ñóïåðíàòàíòó 1/10 îáúåìà 3 Ì NaAc, 2 îáúåìà ýòàíîëà è îñàæäàëè ÄÍÊ ïðè 12000 g â òå÷åíèå 10 ìèí.

            ÏÎËÓ×ÅÍÈÅ ÐÀÄÈÎÀÊÒÈÂÍÛÕ ÇÎÍÄÎÂ

          500 íã ÄÍÊ-ìàòðèöû è 100 íã ïðàéìåðà äåíàòóðèðîâàëè â 10 ìêë âîäû ïðè 100îÑ â òå÷åíèå 10 ìèí è áûñòðî îõëàæäàëè äî 0îÑ. Çàòåì äîáàâëÿëè 10 ìêë 10-êðàòíîãî áóôåðà (40 ìÌ KP04 ðÍ 7,5, 6,6 ìÌ MgCl2 è 1,0 ìÌ 2-ìåðêàïòîýòàíîë), 0,1-0,5 ìÊè 32Ð-dATÔ, 10 ìêë 2 ìÌ ðàñòâîðà òðåõ äðóãèõ íåìå÷åíûõ äÍTÔ äî êîíöåíòðàöèè 200 ìêÌ. Îáúåì ðåàêöèîííîé ñìåñè äîâîäèëè âîäîé äî 100 ìêë, äîáàâëÿëè 3 ìêë ôðàãìåíòà Êëåíîâà ÄÍÊ-ïîëèìåðàçû I (10-12 å.à.) è èíêóáèðîâàëè ïðè êîìíàòíîé òåìïåðàòóðå â òå÷åíèå 30 ìèí. Î÷èñòêó çîíäà ïðîâîäèëè ìåòîäîì ãåëü - ôèëüòðàöèè íà êîëîíêå ñ áèîãåëåì Ï-10 (Ìàíèàòèñ è äð., 1984).

            ÂÛÄÅËÅÍÈÅ ÏËÀÇÌÈÄÍÎÉ ÄÍÊ

          Êëåòêè Escherichia coli, âûðàùåííûå â ñðåäå Ëóðèà-Áåðòàíè (1% NaCl, 1% áàêòî-òðèïòîí, 0,5% áàêòî-äðîææåâîé ýêñòðàêò, ðÍ 7,5) (ñðåäà LB) ñ àìïèöèëëèíîì (50 ìêã/ìë), îñàæäàëè öåíòðèôóãèðîâàíèåì ïðè 4000 g. Çàòåì îñàäîê ñóñïåíäèðîâàëè â áóôåðå STET (8% ñàõàðîçà, 0,5% òðèòîí X-100, 10 ìÌ òðèñ-HCl è 50 ìÌ Na2ÝÄÒÀ, ðÍ 8,0) è äîáàâëÿëè ëèçîöèì äî êîíöåíòðàöèè 0,8 ã/ìë. Ñìåñü èíêóáèðîâàëè ïðè êîìíàòíîé òåìïåðàòóðå â òå÷åíèå 5 ìèí è ïðè 100îÑ â òå÷åíèå 1 ìèí. Ïîñëå ýòîãî êëåòî÷íûé äåáðèñ îñàæäàëè öåíòðèôóãèðîâàíèåì ïðè 16000 g â òå÷åíèå 15 ìèí.

          Äëÿ îñàæäåíèÿ ïëàçìèäíîé ÄÍÊ ê ñóïåðíàòàíòó äîáàâëÿëè 1/10 îáúåìà 3 Ì ðàñòâîðà àöåòàòà íàòðèÿ, ðàâíûé îáúåì èçîïðîïàíîëà è öåíòðèôóãèðîâàëè ïðè 16000 g â òå÷åíèå 15 ìèí ïðè 20îÑ. Çàòåì ïðîìûâàëè îñàäîê äîáàâëåíèåì 80% ýòàíîëà è ïîâòîðíûì öåíòðèôóãèðîâàíèåì â òå÷åíèå 5 ìèí ïðè 20îÑ (Ìàíèàòèñ è äð., 1984).

            Î×ÈÑÒÊÀ ÏËÀÇÌÈÄÍÎÉ ÄÍÊ ÌÅÒÎÄÎÌ ÐÀÂÍÎÂÅÑÍÎÃÎ ÖÅÍÒÐÈÔÓÃÈÐÎÂÀÍÈß Â ÃÐÀÄÈÅÍÒÅ ÏËÎÒÍÎÑÒÈ CsCl

          Íà êàæäûå 10 ìë ðàñòâîðà ïëàçìèäíîé ÄÍÊ, ïîëó÷åííîãî ïîñëå îñàæäåíèÿ ëèçèðîâàííûõ êëåòîê (ñì. Âûäåëåíèå ïëàçìèäíîé ÄÍÊ), äîáàâëÿëè 1 ã ñóõîãî CsCl, ñîëü ðàñòâîðÿëè, ïîñëå ÷åãî íà êàæäûå 10 ìë ðàñòâîðà äîáàâëÿëè 0,8 ìë ðàñòâîðà áðîìèñòîãî ýòèäèÿ ñ êîíöåíòðàöèåé 10 ìã/ìë. Ñìåñü ïîìåùàëè â öåíòðèôóæíûå ïðîáèðêè Beckman, çàïîëíÿëè äîâåðõó ðàñòâîðîì CsCl è áðîìèñòîãî ýòèäèÿ òîé æå ïëîòíîñòè è öåíòðèôóãèðîâàëè â ðîòîðå Ti 60 ïðè 45000 îá/ìèí è òåìïåðàòóðå 20îÑ â òå÷åíèå 36 ÷àñîâ. Ïîñëå ýòîãî îòáèðàëè êîëüöåâóþ êîâàëåíòíî çàìêíóòóþ ïëàçìèäíóþ ÄÍÊ è ýêñòðàãèðîâàëè áðîìèñòûé ýòèäèé èç ðàñòâîðà äî ïîëíîãî îáåñöâå÷èâàíèÿ ðàâíûì îáúåìîì í-áóòàíîëà, ïðåäâàðèòåëüíî íàñûùåííîãî 1 Ì ðàñòâîðîì NaCl.

ÄÍÊ îñàæäàëè öåíòðèôóãèðîâàíèåì ïðè 15000 g, äîáàâèâ ðàâíûé îáúåì 1 Ì ðàñòâîðà NH4Cl è äâà îáúåìà ýòàíîëà. Ïîñëå ïðîìûâàíèÿ ýòàíîëîì îñàäîê ÄÍÊ ðàñòâîðÿëè â âîäå äî êîíöåíòðàöèè 1 ìêã/ìêë (Ìàíèàòèñ è äð., 1984).

            ÒÐÀÍÑÔÎÐÌÀÖÈß ÏÐÎÊÀÐÈÎÒÈ×ÅÑÊÈÕ ÊËÅÒÎÊ

          Õèìè÷åñêàÿ òðàíñôîðìàöèÿ.

          Äëÿ ïîäãîòîâêè êîìïåòåíòíûõ êëåòîê E.coli øòàìì XL-1 Blue MRF ' è âûðàùèâàëè â 100 ìë 2-êðàòíîé ñðåäû Ëóðèà (2% áàêòî-òðèïòîí, 1% áàêòî-äðîææåâîé ýêñòðàêò, 0,1% NaCl, 0,4% ãëþêîçà, ðÍ 7,0) ïðè 37îÑ äî îïòè÷åñêîé ïëîòíîñòè D550=0,35. Êëåòî÷íóþ ñóñïåíçèþ âûäåðæèâàëè ïðè 0îÑ â òå÷åíèå 2 ÷àñîâ. Çàòåì êëåòêè îñàæäàëè öåíòðèôóãèðîâàíèåì ïðè 4000 g, òåìïåðàòóðå 4îÑ è ñóñïåíäèðîâàëè â 50 ìë ëåäÿíîãî áóôåðà À (100 ìÌ CaCl2, 70 ìÌ MnCl2, 40 ìÌ NaAc, ðÍ 5,5). Ïîñëå ýòîãî ñóñïåíçèþ êëåòîê âûäåðæèâàëè ïðè 0îÑ â òå÷åíèå 30 ìèí, ïîñëå ÷åãî êëåòêè îñàæäàëè è ñóñïåíäèðîâàëè â 5 ìë áóôåðà À ñ 15% ãëèöåðèíà.

          Äëÿ òðàíñôîðìàöèè ê 200 ìêë ñóñïåíçèè êîìïåòåíòíûõ êëåòîê äîáàâëÿëè 30 íã ïëàçìèäíîé ÄÍÊ, ðàñòâîðåííîé â 100 ìêë âîäû è âûäåðæèâàëè ïðè 0îÑ â òå÷åíèå 30 ìèí. Çàòåì èíêóáèðîâàëè ïðè 37îÑ â òå÷åíèå 5 ìèí, ïîñëå ÷åãî äîáàâëÿëè 3 ìë ñðåäû LB è èíêóáèðîâàëè ïðè 37îÑ åùå 90 ìèí. Êëåòêè ñîáèðàëè öåíòðèôóãèðîâàíèåì è âûñåâàëè íà ñåëåêòèâíóþ ñðåäó (Ìàçèí è äð., 1988).

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17