Клонирование и анализ генов легких цепей иммуноглобулинов стерляди

ÐÅÇÓËÜÒÀÒÛ

            ÊÎÍÑÒÐÓÈÐÎÂÀÍÈÅ ÁÈÁËÈÎÒÅÊÈ êÄÍÊ È ÅÅ ÑÊÐÈÍÈÍÃ

           êà÷åñòâå èñòî÷íèêà ìÐÍÊ áðàëè ëåéêîöèòû ïåðèôåðè÷åñêîé êðîâè ñòåðëÿäè. Íà îñíîâå ýòîé ìÐÍÊ ñèíåçèðîâàëè êÄÍÊ. Ïîëó÷åííûå ìîëåêóëû êÄÍÊ êëîíèðîâàëè â ïëàçìèäíîì âåêòîðå pBluescript KS(+), ïîñëå ÷åãî òðàíñôîðìèðîâàëè ýòèì âåêòîðîì êëåòêè E.coli øòàììà XL-1 Blue MRF’.  ðåçóëüòàòå ýòîãî áûëà ïîëó÷åíà áèáëèîòåêà êÄÍÊ ïðåäñòàâèòåëüíîñòüþ 6 ìèëëèîíîâ êëîíîâ. Áèáëèîòåêó àìïëèôèöèðîâàëè äî îáúåìà 5 õ 1011 êëåòîê.

          Cóììàðíóþ ïëàçìèäíóþ ÄÍÊ áèáëèîòåêè âûäåëÿëè è èñïîëüçîâàëè â ÏÖÐ ñ ïàðîé ïðàéìåðîâ, îäèí èç êîòîðûõ ãîìîëîãè÷íåí ó÷àñòêó âåêòîðà âáëèçè ñàéòà êëîíèðîâàíèÿ ìîëåêóëû êÄÍÊ è ðàñïîëàãàåòñÿ â êîäèðóþùåé îðèåíòàöèè. Âòîðîé ïðàéìåð âûðîæäåííûé, ñîîòâåòñòâóþùèé íàèáîëåå êîíñåðâàòèâíîìó ó÷àñòêó ïîñëåäîâàòåëüíîñòè J-ñåãìåíòîâ L-öåïåé Èà ïîçâîíî÷íûõ â íåêîäèðóþùåé îðèåíòàöèè (ðèñ. 10).

          Îäèí èç ôðàãìåíòîâ ÄÍÊ, ïîëó÷åííûõ â ðåçóëüòàòå ÏÖÐ, ñîîòâåòñòâîâàë îæèäàåìîìó ðàçìåðó (370 ïí). Ýòîò ôðàãìåíò âûäåëÿëè è ñóáêëîíèðîâàëè â âåêòîðå pBluescript KS(+). Îïðåäåëåíèå íóêëåîòèäíîé ïîñëåäîâàòåëüíîñòè ýòîãî ôðàãìåíòà ïîêàçàëî, ÷òî îí ãîìîëîãè÷åí ãåíàì V îáëàñòè L-öåïåé Èà (Ðèñ. 11).

          Ýòîò ôðàãìåíò áûë èñïîëüçîâàí â êà÷åñòâå çîíäà äëÿ ñêðèíèíãà áèáëèîòåêè êÄÍÊ ëåéêîöèòîâ ñòåðëÿäè. Ñêðèíèíã 4000 êîëîíèé áèáëèîòåêè êÄÍÊ â ìÿãêèõ óñëîâèÿõ ãèáðèäèçàöèè ïîçâîëèë âûÿâèòü ïÿòü êëîíîâ ñ ðàçìåðîì âñòàâêè êÄÍÊ îò 800 äî 1050 ïí. Äëÿ ÷åòêîãî ðàçäåëåíèÿ êëîíîâ ïðîâîäèëè âòîðè÷íûé ñêðèíèíã áèáëèîòåêè êÄÍÊ, ïîñëå ÷åãî âûäåëåííûå êëîíû àìïëèôèöèðîâàëè.

    ïðàìåð Ò3

5'-GCAATTAACCCTCACTAAAGG-3';

    J-ïðàéìåð

5'-A(G/C)(T/C)(T/C)TGGT(T/G/C)CCTTTTCC(A/G)AA-3’

          Ðèñ. 10. Ñõåìà ÏÖÐ. Ò3 ïðàéìåð ðàñïîëàãàåòñÿ âáëèçè ñàéòà êëîíèðîâàíèÿ ìîëåêóëû êÄÍÊ è êîìïëèìåíòàðåí íåêîäèðóþùåé öåïè, J-ïðàéìåð ãîìîëîãè÷åí ó÷àñòêó êîäèðóþùåé öåïè J-ñåãìåíòà ãåíîâ L-öåïåé Èà ïîçâîíî÷íûõ. Îæèäàåìàÿ äëèíà ïðîäóêòîâ îêîëî 400 ïí.

            ÎÏÐÅÄÅËÅÍÈÅ ÏÅÐÂÈ×ÍÎÉ ÑÒÐÓÊÒÓÐÛ

          Îïðåäåëåíà íóêëåîòèäíàÿ ïîñëåäîâàòåëüíîñòü âñòàâêè êÄÍÊ êëîíà Â1. êÄÍÊ êëîíà Â1 ðàçìåðîì 1050 ïí ïðåäñòàâëÿëà ñîáîé ïîëíîðàçìåðíóþ êîïèþ çðåëîãî ãåíà L-öåïè Èà è ñîäåðæàëà 5’-íåòðàíñëèðóåìóþ îáëàñòü, ïîñëåäîâàòåëüíîñòü êîäèðóþùóþ ëèäåðíûé ïåïòèä, V îáëàñòü, Ñ îáëàñòü, à òàêæå  3’-íåòðàíñëèðóåìóþ îáëàñòü (Ðèñ. 11). Íà îñíîâå ïåðâè÷íîé ñòðóêòóðû êëîíà Â1 ñêîíñòðóèðîâàëè è ñèíòåçèðîâàëè òðè ïðàéìåðà, ñîîòâåòñòâóþùèõ êîíñåðâàòèâíûì ðàéîíàì V è C îáëàñòè è èñïîëüçîâàëè èõ äëÿ îïðåäåëåíèÿ íóêëåîòèäíîé ïîñëåäîâàòåëüíîñòè êëîíîâ Å4 è Ñ2. Ïîñëåäîâàòåëüíîñòü êëîíà Å4 áûëà îïðåäåëåíà òîëüêî â îáëàñòè, ïðèìûêàþùåé ê Ò3 ïðîìîòîðó âåêòîðà. Çà èñêëþ÷åíèåì 2 íóêëåîòèäîâ îíà ïîëíîñòüþ èäåíòè÷íà ïîñëåäîâàòåëüíîñòè Â1. Ïîñëåäîâàòåëüíîñòü êëîíà Ñ2 èìåëà õèìåðíûé õàðàêòåð.  îáëàñòè Ò3 ïðîìîòîðà îíà ñîäåðæàëà ôðàãìåíò ñîîòâåòñòâóþùèé 3’ ÷àñòè Ñ ñåãìåíòà êëîíà B1 ñ çàìåíàìè íåñêîëüêèõ íóêëåîòèäîâ.  òî æå âðåìÿ èñïîëüçîâàíèå äëÿ îïðåäåëåíèÿ ïîñëåäîâàòåëüíîñòè ïðàéìåðîâ V è C îáëàñòè ïîêàçàëî, ÷òî ýòà âñòàâêà ñîäåðæèò äîïîëíèòåëüíî ïåðåñòðîåííûé ãåí ëåãêîé öåïè, ñîäåðæàùèé áîëüøóþ ÷àñòü V ñåãìåíòà è âòîðîé Ñ ñåãìåíò, îòëè÷àþùèéñÿ îò ïåðâîãî â îäíîé ïîçèöèè. Ïîñêîëüêó ïîêà íå óäàëîñü îïðåäåëèòü ïîñëåäîâàòåëüíîñòü â îáëàñòè ñòûêà ýòèõ äâóõ ôðàãìåíòîâ âñòàâêè, íåëüçÿ ñêàçàòü, íàõîäÿòñÿ ëè îíè â îäíîé èëè ðàçíûõ îðèåíòàöèÿõ. Ïî-âèäèìîìó, ñõîäíûé õèìåðíûé õàðàêòåð èìååò ïîñëåäîâàòåëüíîñòü êëîíà D2 (äàííûå íå ïîêàçàíû).

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17