Клонирование и анализ генов легких цепей иммуноглобулинов стерляди

          Ñèíòåç êÄÍÊ.

          Ñèíòåç êÄÍÊ ïðîâîäèëè â ñîîòâåòñòâèè ñ ïðîòîêîëîì ôèðìû Stratagene. Ïî ìàòðèöå ïîëè(A)+ÐÍÊ ñèíòåçèðîâàëè ïåðâóþ öåïü êÄÍÊ (ðèñ. 9).

          Ðåàêöèîííàÿ èìåëà ñîñòàâ:

  5 ìêë 10-êðàòíîãî áóôåðà äëÿ ñèíòåçà ïåðâîé öåïè,

  3 ìêë ñìåñè ìåòèë-dÍTÔ,

  2 ìêë ðàñòâîðà ïðàéìåð-ëèíêåðà (1.4 ìêã/ìêë),

  1 ìêë èíãèáèòîðà ÐÍÊàçíîé àêòèâíîñòè,

  1.5 ìêë ôåðìåíòà îáðàòíàÿ òðàíñêðèïòàçà (50 å.à./ìêë),

  âîäà äî ñóììàðíîãî îáúåìà 50 ìêë.

          Ñìåñü èíêóáèðîâàëè ïðè 37îÑ â òå÷åíèå 1 ÷àñà. Çàòåì îõëàæäàëè äî 0îÑ è äîáëÿëè êîìïîíåíòû äëÿ ñèíòåçà âòîðîé öåïè êÄÍÊ:

  20 ìêë áóôåðà äëÿ ñèíòåçà âòîðîé öåïè,

  6 ìêë ñìåñè dÍTÔ,

  88,9 ìêë ñòåðèëüíîé âîäû,

  2 ìêë 32Ð-dÍTÔ (800 Êè/ìÌ),

  2 ìêë ðàñòâîðà ÐÍÊàçûH (1.5 å.à./ìêë),

  11.1 ìêë ÄÍÊ ïîëèìåðàçû I.

          Ñìåñü èíêóáèðîâàëè ïðè 16îÑ â òå÷åíèå 2,5 ÷àñîâ, çàòåì îõëàæäàëè äî 0îÑ è äîáàâëÿëè êîìïîíåíòû äëÿ çàñòðîéêè “ëèïêèõ” êîíöîâ:

  23 ìêë ñìåñè äÍTÔ,

  2 ìêë Pfu ÄÍÊ ïîëèìåðàçû (2,5 å.à./ìêë).

          Ñìåñü èíêóáèðîâàëè ïðè 72îÑ â òå÷åíèå 30 ìèí.

Çàòåì ïðîâîäèëè ýêñòðàêöèþ ðàâíûì îáúåìîì ñìåñè ôåíîë-õëîðîôîðì (1:1) è ðàâíûì îáúåìîì õëîðîôîðìà, ïîñëå ÷åãî îòáèðàëè âîäíóþ ôàçó, äîáàâëÿëè 20 ìêë 3Ì NaAc è 400 ìêë 96% ýòàíîëà è îñàæäàëè êÄÍÊ öåíòðèôóãèðîâàíèåì ïðè 12000 g â òå÷åíèå 12 ìèí.

          Ñøèâêà ìîëåêóë êÄÍÊ ñ âåêòîðîì.

          êÄÍÊ ðàñòâîðÿëè ñ EcoR I àäàïòîðàìè (ðèñ. 9) è èíêóáèðîâàëè ïðè 4îÑ â òå÷åíèå 30 ìèí. Çàòåì äîáàâëÿëè êîìïîíåíòû äëÿ ñøèâêè ìîëåêóë àäàïòîðîâ è ìîëåóë êÄÍÊ:

                        ïðàéìåð-ëèíêåð

          5' CTCGAGTTTTTTTTTTTT  3'

                3' AAAAAAAAAAAA                   5'

           Xho I ñàéò                1-ÿ öåïü          EcoR I àäàïòîð

         3'     ð-CAAAAAAAAAAAA        GAGCACGGCTTAA-ð 5'

                             2-ÿ öåïü 

                             Xho I ñàéò              êÄÍÊ              EcoR I ñàéò

         5'      CTCGAGTTTTTTT,,,,,,,,,CTCGTGCCGAATTC      3’

         3'      GAGCTCAAAAAAA         GAGCACGGCTTAAG      5’

                     ÄÍÊ âåêòîðà                                                      ÄÍÊ âåêòîðà

          Ðèñ. 9. Ñõåìà ñèíòåçà êÄÍÊ ïî ìàòðèöå ïîëè(A)+ÐÍÊ è ñøèâêè ñ ïëàçìèäíûì âåêòîðîì

pBluescript KS(+) ïî ñàéòàì EcoR I è Xho I.

          Îáîçíà÷åíèÿ:,,,,, - ìåòèëèðîâàííàÿ öåïü êÄÍÊ,          -íåìåòèëèðîâàííàÿ öåïü êÄÍÊ.

  1 ìêë 10-êðàòíîãî áóôåðà ëèãèðîâàíèÿ,

  1 ìêë 10 ìÌ ðATÔ,

  1 ìêë ôåðìåíòà ÄÍÊ ëèãàçû ôàãà Ò4 (4 å.à./ìêë).

          Ñìåñü èíêóáèðîâàëè ïðè 4îÑ â òå÷åíèå 2-õ ñóòîê, ïîñëå ÷åãî èíàêòèâèðîâàëè ëèãàçó ïðîãðåâàíèåì ïðè 70îÑ â òå÷åíèå 30 ìèí, îõëàæäàëè äî êîìíàòíîé òåìïåðàòóðû è äîáàâëÿëè êîìïîíåíòû äëÿ ôîñôîðèëèðîâàíèÿ êîíöåâûõ íóêëåîòèäîâ:

  1 ìêë 10-êðàòíîãî áóôåðà ëèãèðîâàíèÿ,

  2 ìêë 10 ìÌ ðATÔ,

  6 ìêë ñòåðèëüíîé âîäû,

  1 ìêë ôåðìåíòà ïîëèíóêëåîòèäíîé êèíàçû ôàãà Ò4 (10 å.à./ìêë).

          Ðåàêöèîííóþ ñìåñü èíêóáèðîâàëè ïðè 37îÑ â òå÷åíèå 30 ìèí. Çàòåì îõëàæäàëè äî êîìíàòíîé òåìïåðàòóðû è äîáàâëÿëè êîìïîíåíòû äëÿ îáðàçîâàíèÿ ëèïêèõ êîíöîâ ïî ñàéòó ðåñòðèêöèè ýíäîíóêëåàçû Xho I:

  28 ìêë áóôåðà 4,

  3 ìêë Xho I (40 å.à./ìêë).

          Ñìåñü èíêóáèðîâàëè ïðè 37îÑ â òå÷åíèå 1,5 ÷àñà. Çàòåì äîáàâëÿëè 5 ìêë 10-êðàòíîãî áóôåðà STE (1 Ì NaCl, 200 ìÌ òðèñ-HCl, ðÍ 7,5, 100 ìÌ Na2ÝÄÒÀ) è ïðîïóñêàëè ÷åðåç êîëîíêó ñ ãåëåì ñåôàêðèë Ñ-500. Ôðàêöèè, ñîäåðæàùèå ìîëåêóëû ñ ðàçìåðîì áîëåå 500 ïí îáúåäèíÿëè è ýêñòðàãèðîâàëè ÄÍÊ ðàâíûì îáúåìîì ñìåñè ôåíîë-õëîðîôîðì (1:1) è ðàâíûì îáúåìîì õëîðîôîðìà. Çàòåì äîáàâëÿëè äâîéíîé îáúåì ýòàíîëà, îñàæäàëè êÄÍÊ öåíòðèôóãèðîâàíèåì, ïðîìûâàëè 80% ýòàíîëîì è ðàñòâîðÿëè â 10 ìêë âîäû. Äëÿ ëèãèðîâàíèÿ áðàëè 5 ìêë ðàñòâîðà êÄÍÊ (600 íã) è 2 ìêë ðàñòâîðà âåêòîðà pBluescript KS(+) (1 ìêã), èìåþùåãî "ëèïêèå" äåôîñôîðèëèðîâàííûå êîíöû ïî ñàéòàì ðåñòðèêöèè ýíäîíóêëåàçàìè EcoR I è Xho I (ðèñ. 9).

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17