Клонирование и анализ генов легких цепей иммуноглобулинов стерляди

Çàòåì äîáàâëÿëè 1 ìêë 10-êðàòíîãî áóôåðà 3, 1 ìêë 10 ìÌ ðàñòâîðà ðATÔ è 1 ìêë ôåðìåíòà ëèãàçû ôàãà Ò4 (4 å.à./ìêë). Ñìåñü èíêóáèðîâàëè ïðè 4îÑ â òå÷åíèå 2-õ ñóòîê, ïîñëå ÷åãî ýêñòðàãèðîâàëè ðàâíûìè îáüåìàìè ôåíîë-õëîðîôîðìà è õëîðîôîðìà.

          Àìïëèôèêàöèÿ áèáëèîòåêè.

          Ýëåêòðîòðàíñôîðìàöèþ ïðîâîäèëè êàê îïèñàíî â ï. Òðàíñôîðìàöèÿ ïðîêàðèîòè÷åñêèõ êëåòîê, ïîñëå ÷åãî âûñåâàëè 1/1000 îáúåìà (2,5 ìêë) ñðåäû SOC  íà ñåëåêòèâíóþ ñðåäó ñ àìïèöèëëèíîì (50 ìêã/ìë) äëÿ îïðåäåëåíèÿ êîëè÷åñòâà òðàíñôîðìèðîâàííûõ êëåòîê. Îñòàëüíóþ ÷àñòü ïîìåùàëè â 100 ìë ñðåäû LB ñ àìïèöèëëèíîì (50 ìêã/ìë) è èíêóáèðîâàëè ïðè 37îÑ ïðè ïåðåìåøèâàíèè äî òåõ ïîð, ïîêà îïòè÷åñêàÿ ïëîòíîñòü íå äîñòèãíåò âåëè÷èíû D550=2-2,5. Çàòåì îòáèðàëè 1,6õ1011 êëåòîê, îñàæäàëè èõ öåíòðèôóãèðîâàíèåì, ñóñïåíäèðîâàëè â 4 ìë ñðåäû LB è ïåðåìåøèâàëè ñ 4 ìë ãëèöåðèíà. Ïîëó÷åííóþ áèáëèîòåêó õðàíèëè ïðè -70îÑ.

            ÏÎËÈÌÅÐÀÇÍÀß ÖÅÏÍÀß ÐÅÀÊÖÈß

          Ðåàêöèîííàÿ ñìåñü ïîëèìåðàçíîé öåïíîé ðåàêöèè (ÏÖÐ) ñîäåðæàëà ñëåäóþùèå êîìïîíåíòû:

  100 íã ÄÍÊ ìàòðèöû,

  100 íã íåâûðîæäåííîãî ïðàéìåðà,

  500 íã âûðîæäåííîãî ïðàéìåðà,

  5 ìêë 2 ìÌ ðàñòâîðà äÍTÔ,

  5 ìêë 1-êðàòíîãî áóôåðà (10 ìÌ òðèñ-HCl, ðÍ 8,8, 50 ìÌ KCl, 1,5 ìÌ MgCl2, 0,001% æåëàòèí),

  1 ìêë Taq ïîëèìåðàçû,

  âîäà äî êîíå÷íîãî îáúåìà 50 ìêë (Dieffenbach and Dveksler, 1995).

           Òåìïåðàòóðíûé ðåæèì ÏÖÐ.

          Ðåàêöèîííóþ ñìåñü èíêóáèðîâàëè ïðè 95îÑ â òå÷åíèå 5 ìèí, ïîñëå ÷åãî äîáàâëÿëè Taq ïîëèìåðàçó è èñïîëüçîâàëè òåìïåðàòóðíûé ðåæèì, ïðè êîòîðîì â òå÷åíèå ïåðâûõ 18 öèêëîâ òåìïåðàòóðó îòæèãà ïðàéìåðîâ ïîíèæàëè íà 3îÑ ÷åðåõ êàæäûå òðè öèêëà:

1é-18é öèêëû      95îÑ -    1 ìèí    (äåíàòóðàöèÿ ÄÍÊ),

                      50-35îÑ - 1 ìèí   (îòæèã ïðàéìåðîâ),

                      72îÑ -     2 ìèí   (ïîëèìåðèçàöèÿ).

19-é-30-é öèêëû:  95îÑ     - 1 ìèí,

                      50îÑ -     1 ìèí,

                      72îÑ -     2 ìèí.

31-é öèêë:          95îÑ -     1 ìèí,

                      50îÑ -     1 ìèí,

                      72îÑ -    10 ìèí.

            ÑÓÁÊËÎÍÈÐÎÂÀÍÈÅ ÄÍÊ

          Ôðàãìåíòû ÄÍÊ, ïîëó÷åííûå â ðåçóëüòàòå ÏÖÐ, ðàçäåëÿëè â 1% àãàðîçíîì ãåëå è âûäåëÿëè êàê îïèñàíî â ï. Âûäåëåíèå ÄÍÊ èç ãåëÿ. Çàòåì îñàæäàëè ÄÍÊ ýòàíîëîì, ðàñòâîðÿëè â 5-10 ìêë âîäû è äîáàâëÿëè êîìïîíåíòû äëÿ óäàëåíèÿ âûñòóïàþùèõ íóêëåîòèäîâ ñ 3' êîíöà ÄÍÊ:

  1 ìêë 10-êðàòíîãî áóôåðà (200 ìÌ òðèñ-HCl, ðÍ 8,2, 100 ìÌ KÑl, 60 ìÌ (NH4)2SO4, 20 ìÌ MgCl2, 1% òðèòîí Õ-100 è 100 ìêã/ìë áû÷èé ñûâîðîòî÷íûé àëüáóìèí),

  1 ìêë 10 ìÌ dÍTÔ,

  1 ìêë Pfu ÄÍÊ ïîëèìåðàçû (2,5 å.à./ìêë),

  âîäó äî êîíå÷íîãî îáúåìà 10 ìêë.

          Ñìåñü èíêóáèðîâàëè 30 ìèí ïðè 72îÑ ïîñëå ÷åãî îõëàæäàëè äî 0îÑ è äîáàâëÿëè êîìïîíåíòû äëÿ ñøèâêè ñ âåêòîðîì pBluescript KS(+) ïî ñàéòó ðåñòðèêöèè Sma I:

  1 ìêë ðàñùåïëåííîãî âåêòîðà (0,5 ìêã),

  1 ìêë 10-êðàòíîãî áóôåðà (50 ìÌ òðèñ-HCl, ðÍ 7,5, 7 ìÌ MgCl2, 1 ìÌ ÄÒÒ),

  1 ìêë 10 ìÌ äATÔ,

  1 ìêë ÄÍÊ ëèãàçû ôàãà Ò4 è âîäó äî êîíå÷íîãî îáúåìà 10 ìêë.

          Ñìåñü èíêóáèðîâàëè îäíè ñóòêè ïðè êîìíàòíîé òåìïåðàòóðå è çàòåì èñïîëüçîâàëè äëÿ õèìè÷åñêîé òðàíñôîðìàöèè êëåòîê E.coli. Òðàíñôîðìèðîâàííûå êëåòêè âûñåâàëè íà ñåëåêòèâíóþ ñðåäó: 1,5% LB-àãàð ñ àìïèöèëëèíîì (50 ìêã/ìë), òåòðàöèêëèíîì (15 ìêã/ìë), ÈÏÒà (2 ìÌ), X-Gal (500 ìêã/ìë) è èíêóáèðîâàëè 14 ÷àñîâ ïðè 37îÑ. Ïîñëå ýòîãî îòáèðàëè êîëîíèè áåëîãî öâåòà (Ìàíèàòèñ è äð., 1984; Dieffenbach and Dveksler, 1995).

            ÑÊÐÈÍÈÍà ÁÈÁËÈÎÒÅÊÈ êÄÍÊ

          Áèáëèîòåêó êÄÍÊ âûñåâàëè íà ÷àøêè Ïåòðè ñ 1,5% LB-àãàðîì ñ àìïèöèëëèíîì (50 ìêã/ìë) èç ðàñ÷åòà 4000 êîëîíèé íà ÷àøêó è èíêóáèðîâàëè ïðè 37îÑ äî òåõ ïîð ïîêà êîëîíèè íå äîñòèãíóò 0,5-1 ìì â äèàìåòðå. Êîëîíèè ïåðåíîñèëè íà íåéëîíîâóþ ìåìáðàíó è èíêóáèðîâàëè ïðè êîìíàòíîé òåìïåðàòóðå â äåíàòóðèðóþùåì ðàñòâîðå (0,5 Ì NaOH, 1,5 Ì NaCl) â òå÷åíèå 7 ìèí è äâà ðàçà ïî 2 ìèí â íåéòðàëèçóþùåì ðàñòâîðå (1,5 Ì NaCl, 0,5 Ì òðèñ-HCl, ðÍ 7,5). Çàòåì ñïîëàñêèâàëè ìåìáðàíó â 2-êðàòíîì áóôåðå SSC (0,3 Ì NaCl, 0,03 Ì öèòðàò íàòðèÿ), âûñóøèâàëè è ôèêñèðîâàëè ÄÍÊ â òå÷åíèå 10 ìèí óëüòðàôèîëåòîâûì èçëó÷åíèåì ñ äëèíîé âîëíû 310 íì. Ïîñëå ýòîãî ìåìáðàíó ïîìåùàëè â 50 ìë ïðåäãèáðèäèçàöèîííîãî ðàñòâîðà (ðàñòâîð 1), ñîäåðæàùåãî:

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17